基因敲入/点突变大鼠构建技术原理及流程

基因敲入大鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。

基因敲入大鼠包括：点突变、片段基因敲入。

点突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒并转录为RNA，再合成含有突变位点信息的donor oligo，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠；

2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠；

3、选择来自同一只F0代大鼠，敲入位点一致的F1代大鼠，达到性成熟后进行同胞交配，可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为敲入位点一致的纯合子大鼠，有50%为只有一条染色体敲入的杂合子大鼠，有25%为野生型大鼠。

片段基因敲入的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒和含有突变位点信息的donor vector，将以上质粒转录为mRNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠；

2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR鉴定基因型和测序鉴定随机插入的F1代杂合子大鼠；

3、选择来自同一只F0代大鼠，敲入位点一致的F1代大鼠，达到性成熟后进行同胞交配，可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为敲入位点一致的纯合子大鼠，有50%为只有一条染色体敲入的杂合子大鼠，有25%为野生型大鼠。