最新综述：耳鼻喉科医生最关注的鼓膜再生研究新进展
本文为ENT时空原创，
鼓膜再生和生物工程的目的是提高手术成功率，增加不同支架的可用性，并提供可以简化手术技术创新的工具，使不同专业水平的手术医生能够实施手术。
近年来，人们发展了模拟正常鼓膜增殖的新技术，以及从瘢痕组织的小样本中分离和扩增正常鼓膜角质形成细胞的新技术。
正在进行的临床试验旨在通过在鼓膜上应用由生长因子渗透的各种支架来封闭穿孔，结果令人振奋。
人的鼓膜是一块独特的皮肤膜片。它是唯一被鳞状上皮覆盖的盲袋，其角质形成细胞横向迁移以避免闭塞。鼓膜也是唯一悬空生长的皮肤，这使得它的愈合过程更具挑战性。鼓膜穿孔（tympanic membrane perforations，TMPs）主要由中耳反复感染、外伤或压力平衡管道脱出所致。尽管绝大多数急性穿孔会自动愈合，但6-12周内不能愈合的慢性穿孔通常需要手术治疗。鼓膜成形术和鼓膜修补术常被用来矫正TMP，以创造一个“安全”的中耳，并恢复声音的传导。鼓膜的手术修复取决于鳞状上皮层的再生能力。其中最常用的技术是用纸修补的嵌合移植物支架，用自体脂肪/软骨移植物封堵，到用自体组织（筋膜或软骨膜）做衬垫移植物或覆盖移植物支架。通常，这些手术需要使用手术室和麻醉。鼓膜再生方面的创新试图寻找一种经济、简单、可靠和安全来替代传统方法。这些进展集中在组织工程，促进角质形成细胞的增殖和迁移，以及在不同的支架上取代目前的自体移植物。
本文作者承认当前文献丰富，并希望总结当前正在研究的突出主题和最先进的技术。
最常见的鼓膜疾病与穿孔有关，可能伴有耳漏、传导性听力损失、单词辨别评分降低、胆脂瘤和耳鸣。人们普遍认为鼓室成形术的成功率约为90%。然而，对文献的深入回顾显示，这一比率可能会显著下降。影响手术成功的多种因素取决于内在因素，如咽鼓管功能、穿孔的大小和位置、慢性化脓性中耳炎或慢性乳突炎以及手术技术。另外，特殊情况使修复工作复杂化，包括翻修手术、先天性畸形、辐射组织、活跃的烟草滥用和疏忽围手术期预防措施，即使在转诊中心也是如此。据推测，这些病例可能受益于再生医学研究中的创新，重点是开发新的疗法来促进再上皮化和使用新的支架。
另外，促进再上皮化适用于超出鼓膜范围的疾病。需要加强上皮细胞的增殖和迁移以覆盖裸露的骨骼，限制粘液化和肉芽组织，这是我们治疗大部分乳突管下壁切除术后慢性耳漏的基础。乳突管下壁切除术常导致乳突骨外露。通常情况下（5-40%），耳道内部分覆盖粘膜和肉芽组织，导致耳漏、感染，需要多次额外就诊治疗。控制粘膜化的尝试包括外用抗生素、类固醇激素、烧灼和自体中厚皮片移植。同样，以鼓膜角质形成细胞层丢失为特征的慢性鼓膜炎也对耳鼻喉外科医生提出了挑战，因为耳鼻喉外科医生有过多的治疗方法，但没有普遍成功。鼓膜再生方面的创新可能有助于增强和潜在地治疗这些临床疾病，并对耳鼻喉外科临床实践产生重大影响。
本文作者认为存在三个差距：提高“挑战性鼓膜成形术”的成功率；促进鼓膜的再上皮化；扩大抢救情景中可供选择的支架。通过这篇综述，我们希望向读者传达当前最先进的进展，因为它适用于当前和未来的临床应用。
在严重烧伤的情况下，慢性皮肤创面、广泛的皮肤丢失和缺乏可供自体移植的皮肤都与显著的并发症发生率和死亡率有关。在过去的几十年里，寻找皮肤的替代来源一直是再生医学和生物工程领域的相关课题。在下一节中，我们将回顾与鼓膜再生相关的皮肤再生医学和生物工程方面的成就和最新进展，我们相信40年的经验对鼓膜再生也有帮助。
临床上第一次使用培养的自体上皮移植物（cultured epithelium autografts，CEA）覆盖大面积烧伤表面是在1981年。CEA是从清创的烧伤皮肤（废弃组织）中分离出来的，在近20年的经验中被证明在临床上对73%的患者来说是可行的（印第安纳大学，2010年，88例患者）。CEA法的主要缺点是培养的自体表皮细胞成熟需要2-3周，培养细胞的分化最终会失去正常的迁移功能，需要恰当的时间。另外，CEA片很脆弱，应该小心移植，以避免过度的压力或剪切力。并且，CEA法目前价格昂贵，需要有经验的实验室来分离和培养上皮细胞。
真皮替代物（与表皮不同）提供与真皮细胞外基质（dermal extracellular matrix，ECM）同源的结构，促进血管化组织的完整性、弹性和美容效果。不同的人工生物真皮替代物已经在临床上应用多年。据报道，牛胶原蛋白和6-硫酸软骨素生物移植物（美国新泽西州普林斯顿的INTEGRA生命科学公司）可以提供良好的美学和功能效果，至少与普通皮片相当，而且使用的供体部位更小，愈合也更快。考虑到天然鼓膜的相对厚度，真皮移植物的使用受到限制，因为它涉及到TMP修复。下一个主要进展是开发不含抗原性细胞成分的脱细胞真皮移植物，这种移植物保留了正常细胞外基质的大部分生物和机械结构。然而，这些移植物被发现在真皮移植物和表皮移植物之间的粘附性很差，可能是由于真皮移植物中缺少成纤维细胞所致。今天，已经确定成纤维细胞和角质形成细胞之间的相互连接和信号传递对于伤口愈合过程中表皮基底膜的形成是必不可少的。
为了寻找一种使用移植物保持上皮-间充质相互作用的单一技术，利用细胞培养技术开发了一种真皮—表皮自体皮肤替代物（美国俄亥俄州辛辛那提的PermaDerm公司）。它包括获取10-20 cm2的自体皮肤移植物（比适用于耳鼻喉外科手术大几个数量级）。皮肤细胞在原代培养中生长，然后在第二代培养中通过接种高细胞密度的成纤维细胞和高细胞密度的角质形成细胞（相隔1-2天）在胶原-糖胺聚糖基质（10cm2）上进行扩增。整个过程大约需要30天。
最后，正在研究的其他新方法在等待临床试验的显著良好结果，这些方法是通过直接应用或通过诱导向角质形成细胞分化来使用多能干细胞。
在讨论鼓膜再生时，重要的是要讨论皮肤复层鳞状上皮与鼓膜的独特区别。鼓膜缺乏皮肤附属物，比较脆弱，角蛋白层容易脱落。另外，与正常皮肤不同，鼓膜角质形成细胞在正常情况下迁移，这也反映在不同的基因表达上。另外，鼓膜的伤口愈合经历了不同的过程，而第一个显示迁移和跨越间隙的细胞是角质形成细胞，而不是成纤维细胞，这与皮肤伤口愈合过程相反。鼓膜的独特特性表明，从正常皮肤伤口愈合模型中得出的任何结论都应谨慎应用于鼓膜再生。
我们通过回顾皮肤再生积累的经验得出的结论是，鼓膜再生的尝试应该提供一个使间充质与表皮相互作用的环境，并可能遵循CEA法，利用“废弃组织”创造新的组织用于再次移植。
下面将包括与生物工程领域相关的三个部分：支架、生物活性分子（调节因子）和细胞。我们将把重点放在体内和体外类别上，以回顾最新或最具开创性的研究成果。体内部分集中于评估不同支架或生长因子对慢性TMP愈合过程的影响以及成功闭合穿孔的机会的研究。体外部分描述了研究鼓膜细胞培养和探索TMP愈合过程的细胞方面的文章。本文作者还请读者参阅Teh等人广泛而有条理的评论。
急性穿孔的高自愈率是基于天然鼓膜角质形成细胞增殖和迁移的固有再生能力。Knutsson等人应用免疫组织化学和免疫荧光技术证实，在经迷路手术中用锤骨柄整块切除的健康人鼓膜上存在潜在的前体角质形成细胞。干细胞标记物（α6-整合素、β1-整合素和细胞角蛋白-19）在鼓膜凸附近、锤骨柄和环状韧带有较高的表达，提示可能是祖细胞在鼓膜角质形成细胞中的局灶。在急性和慢性TMP的大鼠模型中也发现了类似的结果。
>>细 胞
近年来鼓膜细胞培养领域的一些最大成就来自西澳大利亚大学。2017年，Liew等人提出利用健康大鼠鼓膜建立细胞培养模型。将锤骨和附着的鼓膜培养在聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（polyethylene terephthalate membrane）上，并为锤骨设计一个狭缝，使鼓膜与锤骨的正常解剖三维关系得以保存。培养物中含有角质形成细胞无血清培养基（keratinocyte serum-free media，KSFM），其中含有丰富的表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和胎牛血清。这一方案产生了上皮和成纤维细胞形态的细胞，这些细胞以单层的形式生长，并从作为再生和增殖中心的锤骨和鼓膜凸迁移出去，类似于正常和健康的鼓膜。接下来，这些细胞被分离出来，并在多孔丝膜支架（porous silk membrane scaffold）上重新培养，既往的研究已经表明，这是一种潜在的TMP愈合过程的支架。在几个小时内，多孔丝膜支架被一层细胞覆盖，形成了组织工程膜。在他们接下来的研究中，Liew等人收集了3天前接受鼓膜切开术的大鼠鼓膜，利用急性损伤后的增殖期增加产生的细胞数量（图1）。鼓膜的培养采用类似的技术。值得注意的是，从再生中心观察到两种细胞系，成纤维细胞（梭形细胞样外观）和上皮细胞（鹅卵石样外观）。上皮细胞呈β1-整合素和细胞角蛋白-19免疫组织化学染色阳性。有关进行大鼠鼓膜细胞培养的确切方案的更多细节，作者请读者参考Liew等人以及《从大鼠鼓膜中分离表皮前体细胞》一章。
图1：大鼠鼓膜来源干细胞样细胞培养用于组织再生。鼓膜切开术后3天整块取鼓膜（以激活再生中心）。在IV型胶原包被的孔中培养锤骨和附着的鼓膜，并为锤骨设计一个狭缝，使鼓膜与锤骨的正常解剖三维关系得以保存。从再生中心可观察到两种细胞系，成纤维细胞（梭形细胞样）和上皮细胞（鹅卵石样）。（A）切除鼓膜凸种植于培养孔上，能够以连续的方式产生细胞；（B）大鼠鼓膜上皮细胞。刻度尺=500mm。
来自使用“废弃组织”治疗皮肤CEA临床成就的灵感，并基于Liew等人描述的技术，Sagiv等人建立了与鼓膜角质形成细胞融合的培养物，这些角质形成细胞既有正常的形态，也有正常的基因表达，这些角质形成细胞来自于在标准鼓室成形术过程中收获的慢性TMP的疤痕边缘。将分离的细胞接种于含血清培养基（serum containing media，SCM）和KSFM（添加胎牛血清和其他生物活性分子）中。种植在KSFM中的细胞显示出上皮的、立方的健康形态，与SCM培养的细胞呈梭形细胞样的成纤维细胞形态相反（图2）。实时定量逆转录-PCR检测正常鼓膜角质形成细胞的几个基因的表达。结果支持形态学发现，新鼓膜角质形成细胞（在KSFM中培养）的基因表达与正常鼓膜角质形成细胞是相容的，与具有成纤维细胞外观的细胞（来自同一标本但在SCM中培养的细胞）以及作为对照的正常人皮肤角质形成细胞（图2）显著不同。这证明了从微小TMP瘢痕边缘分离和扩增正常鼓膜角质形成细胞的可行性，也是从微型“废弃组织”中提取鼓膜CEA的第一步。
图2：从瘢痕穿孔边缘分离和扩增鼓膜鳞状上皮干细胞的可行性。（a）切除的疤痕边缘鼓膜穿孔（黑色箭头）。（b和c）生长培养基对人鼓膜来源细胞形态的影响，接种后15d：用角质形成细胞无血清培养液（b）培养的细胞显示出上皮形态，而不是用含血清培养液（c）培养的细胞呈现成纤维细胞的形态。（d）比较人鼓膜来源的角质形成细胞（点状）与人鼓膜来源的成纤维细胞（横纹状）、正常人皮肤角质形成细胞（黑色，左侧柱状）和正常人成纤维细胞（斜纹状）的基因表达。人鼓膜来源的角质形成细胞与正常人皮肤角质形成细胞相比，FOXC2和VCAN基因的表达显著增高。这些基因与细胞迁移的调节有关，表明这些细胞保留了正常鼓膜组织的一些特征。*P值小于0.05（t检验，双尾）。hTM，人鼓膜；hTMFib，人鼓膜来源的成纤维细胞；hTMKR，人鼓膜来源的角质形成细胞；KSFM，角质形成细胞无血清培养液；NhSKR，正常人皮肤角质形成细胞；SCM，含血清培养液
>>支 架
不同类型的移植物已被用于鼓膜工程试验，包括同种移植物（即硬脑膜，美国阿拉巴马州伯明翰AlloDerm公司）、异种移植物[即猪小肠粘膜下层（smallintestinal submucosa，SIS）、猪尿路膀胱基质（urinarybladders matrix，UBM）]和合成材料（即明胶海绵、纸、丝、凝胶、透明质酸、细菌纤维素、胶原和壳聚糖）。其中许多移植物被证明可以降低供体部位的并发症发生率，缩短手术时间，避免额外的切口。
Parekh等人采用南美栗鼠模型，制作双侧慢性TMP（n=11；紧张部大小的25-75%），用5 mm大小的脱细胞猪UBM片覆盖穿孔，进行单侧鼓膜成形术。术后12周，穿孔闭合率为100%（对侧耳为63.6%）。组织学上显示，补片鼓膜恢复了正常鼓膜的三层结构，尽管与对照组相比增厚，但含有更好的胶原组织。在组织学上没有观察到UBM补片的可辨认残留物。这些结果表明，UBM是一种可吸收的、临时性的组织重塑模板，为诱导组织修复提供了关键的结构和ECM。脱细胞猪SIS是另一种在南美栗鼠身上成功试验的异种移植物，目前正在临床上用于鼓膜成形术和内外侧移植物鼓室成形术，包括儿童患者群体。据报道，在这些研究中，SIS同样易于使用，适用于翻修病例。根据，Basonbull和Cohen的经验，SIS移植物大小适合于定制修剪，具有足够的厚度和一致性，以适应重建所需的三维形状。他们主张SIS适用于翻修病例，同时也可以减少手术时间。
非细胞真皮基质是从人大体皮肤（AlloDerm公司）中加工而成，用于皮肤伤口修复。尽管它有几个缺点（价格昂贵，可获得性有限，并且比正常鼓膜厚得多），但它被证明是安全的，在成人患者群体（n=19）和儿童患者群体（n=26）中都有良好的手术结果。据报道，与筋膜移植相比，内外侧移植修复穿孔的成功率相似，建议将其作为翻修病例的可选支架。
最近在TMP修复的一项随机对照研究中测试的另一种支架是细菌纤维素（Polisa，巴西伯南布哥联邦农村大学卡皮纳市甘蔗实验中心）。Polisa是一种纤维素多糖，由细菌合成。在既往的非耳鼻喉外科研究中，细菌纤维素被证明是一种安全的、生物相容的产品，促进了细胞的生长和分化。Silveira等人将全身麻醉下的普通内侧筋膜移植物与放置在TMP上的细菌纤维素移植物进行比较（每个分支n=20，穿孔大小无差异）。细菌性纤维素分支对小穿孔的成功率为100%，对中型穿孔的成功率为66.7%，仅略好于筋膜植入术（不显著）。使用细菌纤维素可以显著缩短手术时间（14分钟对76分钟），并降低每位患者的住院费用。到目前为止，细菌纤维素在治疗慢性TMP方面还没有进一步的应用。
>>生长因子
据报道，有几种生长因子参与了TMP的愈合过程。EGF被证明是安全的（无耳毒性），对动物模型有显著的积极作用。与安慰剂相比，人体体内研究没有显示出成功的差异。在成纤维细胞生长因子（fibroblastic growth factor，FGF）家族中，β-FGF是研究最多的因子，具有局部应用的安全性。β-FGF促进角质形成细胞的增殖和迁移，促进成纤维细胞增殖。一项动物研究报道，β-FGF可能导致结缔组织肥大和大量瘢痕形成；在人体中没有得到证实。临床上，β-FGF被测试于急性和慢性TMP中。Hakuba等人在2003-2014年间，使用β-FGF对245例患者进行了三项临床试验。他们使用局部β-FGF，并测量穿孔的完全闭合情况，发现小的中央穿孔100%完全闭合，大的穿孔48%完全闭合。进一步分析发现，边缘穿孔是残留穿孔的最重要术前危险因素，失败率为56%，优势比为4.1%（P<0.001）。
也许在生长因子方面最有希望的研究是由Kanemaru等人进行的。对53例干性慢性TMP患者进行了穿孔边缘清创修补术，然后覆盖以β-FGF浸泡的明胶海绵（提供支架和生长因子的缓释）。然后将纤维蛋白胶滴在海绵上，以确保支架保持在原位和潮湿（图3）。术后3周切除痂皮，假如需要，最多重复4次。总的穿孔闭合成功率为98.1%。小穿孔（小于1/3鼓膜，n=9）和中型穿孔（鼓膜的1/3至2/3；n=25）成功率为100%（图3）。唯一一例未能完全修复的病例是大穿孔（鼓膜2/3以上），成功率为94.7%（n=19）。手术持续时间为7-15分钟，描述的主要困难是7例（13.2%）患者的穿孔前部可视化。Kanemaru最初工作的后续研究最近发表，扩大了中鼓室胆脂瘤（n=25；不延伸到面部隐窝/鼓室隐窝）、小鼓室球（n=3）和鼓膜严重钙化患者（n=17）的标准。鼓膜重建术按相同方案进行。对胆脂瘤患者分别随访12个月和6个月。术后即刻（3周）穿孔完全愈合率为95.6%（43/45），随访结束时成功率为91%（41/45）。术后1年未见胆脂瘤复发。与手术相关的并发症包括治疗后几天的浆液性耳漏，较大穿孔的鼓膜轻微回缩，以及临床上摘除的上皮珠（epithelial pearl）。两项研究均未发现感染或严重后遗症。
图3：经鼓膜穿孔边缘清创及应用浸泡成纤维细胞生长因子的明胶海绵修复鼓膜穿孔。65岁女性慢性中耳炎持续30年。（A）中型干性鼓膜穿孔；（B）穿孔边缘破裂；（C）将含有β-成纤维细胞生长因子的明胶海绵置于鼓膜穿孔上方，并用纤维蛋白胶封闭；（D）治疗3周后鼓膜完全再生。（E和F）术后4个月，轻度肥大组织变薄，鼓膜基本正常，血运丰富。
作者期待着即将到来的多中心临床比较试验，该试验正在等待发表，以及西澳大利亚大学和美国马萨诸塞州波士顿马萨诸塞州Eye and Ear公司的另外两项临床试验（第二阶段）的结果。
本领域另一种有希望的生长因子是肝素结合的EGF样生长因子（heparin-bindingEGF-like growth factor，HB-EGF），它被证明对3月龄大鼠的慢性穿孔有效。HB-EGF以水凝胶聚合物（含有壳聚糖、聚乳酸和纤维蛋白原，以焦亚硫酸钠为交联剂）为载体，并与另外两个使用EGF和β-FGF的处理组进行比较。HB-EGF的治疗效果明显改善，并成功地将听力恢复到接近正常的基线。HB-EGF在这项研究中的独特和有希望的成就是穿孔的边缘没有清创，从而可以最大限度地减少所需的手术器械和技能。人体模型试验已经批准了第一阶段和第二阶段，即将启动。
作者认为目前鼓膜再生最有前途的方法是在经管鼓室成形术中应用支架内的生长因子。在动物和人体研究中都报告了令人鼓舞的结果，我们期待着最近进行或即将开始的临床试验（β-FGF和HB-EGF）。有两个有趣的方向在医学的其他领域显示出有希望的结果，值得注意，本综述中没有涉及到：
（1）Kozin等人报道了鼓膜移植物支架的三维生物打印。他们进行了一项体外研究，以测试其机械性能。以及Kuo等人进行。（2018）世界卫生组织对南美栗鼠进行了第一次体内研究，使用了加载了EGF的生物打印明胶。
（2）间充质干细胞是典型的成体干细胞，通过释放刺激内源性组织祖细胞增殖和分化的介质来促进组织修复。它已在动物模型上进行了测试，使用了不同的支架，包括三维生物打印。在临床应用之前，还需要进一步的研究。
鼓膜穿孔是耳鼻喉科常见的疾病，在某些情况下其手术治疗可能具有挑战性。鼓膜再生的目的是通过促进鼓膜角质形成细胞的增殖和迁移，为更新正常鼓膜所需的细胞外基质提供条件，从而提高穿孔愈合的成功率，减少手术干预。近年来，我们见证了鼓膜再生方面的一些实质性进展——利用新的技术模拟正常鼓膜增殖，使新的生长因子和支架的开发和测试成为可能。几项临床试验已经证明，这些新材料可以成功地用于动物模型和人体的微创手术，以闭合穿孔。随着几组生物工程科学家和神经病学家向更多的临床试验迈进，我们很可能会看到鼓膜再生在耳鼻喉外科临床实践中的更多应用。