经颅直流电刺激(tDCS)可以改善健康受试者工作记忆(WM)的表现。然而，不同文献得到的结论并不一致，也有认为没有效果，且对这些结果的解释是混乱的，包括tDCS强度(电流强度)和伪刺激的差异。目的：我们利用行为学和神经生理学结果系统地研究tDCS强度对工作记忆的影响。方法：采用单盲平行分组设计，将100名受试者随机分为5组，分别接受不同电流强度(2 mA、1 mA和3种伪TDCS条件，分别为0.034 mA、0.016 mA和0 mA)15min的双额tDCS刺激。被试在tDCS之前、期间和之后执行WM任务时采集EEG信号，评估反应时、准确率和事件相关脑电位P3成分。 结果：我们发现不同的电流强度在反应时或操作准确率上没有显著差异。与0.034 mA、1 mA和2 mA tDCS条件相比，0 mA条件下的P3波幅显著降低。与基线水平相比，WM准确率的变化与tDCS后额叶P3波幅(通道Fz)的变化呈中度相关(r=0.34)。结论：无论刺激强度大小如何，tDCS对工作记忆均无明显影响。P3波幅显示1 mA、2 mA刺激和伪刺激(0.034 mA)均有生物学效应，1 mA刺激的效应幅度最大。这些发现表明神经生理学结果对tDCS有更高的敏感性，并提示先前被认为无效果的伪刺激也可能改变神经元功能。本文发表在Brain Stimulation杂志。思影曾解读Nature neuroscience杂志的关于脑刺激与工作记忆的文章，可结合阅读（直接点击即可浏览）：
1 Introduction
经颅直流电刺激(tDCS)是一种非侵入性的脑刺激技术，是一种很有前途的认知增强技术，可以增强学习、记忆和注意力等心理过程。研究表明，工作记忆的增强能在其他认知领域产生更多益处，包括流体智力。事实上，在多项系统综述中，向左背外侧前额叶皮质(DLPFC)(大脑中参与工作记忆过程的一个区域)的阳极tDCS已被证明显著改善了表现。然而，这些综述结合了具有不同刺激参数和实验设计的研究结果，阴性和阳性结果相互混淆，总体效果较小。这种异质性使增强工作记忆的最佳参数(如tDCS强度)的确定变得复杂。此外，最近的研究提出了一些担忧，即伪tDCS方案(通常与tDCS的效果进行比较)可能提供足够的电流强度来改变大脑活动并产生行为影响。因此，有必要系统地研究tDCS强度，以了解电流强度对健康受试者工作记忆增强的相对贡献。
尽管现有证据表明，对DLPFC的tDCS可改善认知，但确定最佳tDCS强度的努力却产生了矛盾的结果。到目前为止，只有两项研究经验性地检验了不同tDCS电流强度对健康被试工作记忆结果的影响。Hoy等人研究了tDCS强度(阳极1 mA和2 mA传递到左侧DLPFC)对刺激后工作记忆性能的影响( 'offline’)，发现在不同刺激强度下使用3-back任务对反应时和准确率方面没有显著差异。有趣的是，在工作记忆负荷较低的2-back任务中，他们观察到1 mA刺激后的反应时有所改善，而不是2 mA。相反的，Teo等人在3-back任务时，采用online模式，即刺激和任务同步，2 mA的tDCS显示出更快的响应时间，而不是1 mA的情况。Dedoncker等人对tDCS的认知效应进行了meta分析，发现电流强度不影响准确率或反应时间。作者总结说，试验之间显著的异质性可能降低了评估应答预测因素的能力，包括tDCS强度的影响。因此，仍有必要在单个试验中测试tDCS强度对工作记忆结果的影响。
tDCS强度的影响也与用作控制条件的伪刺激方案相关。伪刺激包括短时（10-60s）电流上升到与正常tDCS刺激条件类似的水平，然后是类似持续时间的下降阶段。电流强度的这种变化通过产生超感效应复制了正常tDCS刺激的感觉，从而让被试无法区分是否进行tDCS刺激，这样就可以将tDCS结果与伪刺激的结果进行比较。关于电流的精确持续时间和电流下降阶段之后的输出大小的研究之间存在差异。由于伪刺激所用电流强度低，伪刺激方案通常被认为是不能引起神经上的改变，然而，最近的研究结果初步表明，tDCS伪刺激可能改变神经活动。Boonstra等人收集了tDCS前后的静息态EEG数据，发现在刺激和伪刺激状态下，平均脑频率都有类似的降低，只是效果大小不同。类似的，tDCS治疗抑郁症的试验发现，与2.5 mA的tDCS相比，在实验的伪刺激控制阶段，接受伪刺激的被试的情绪有更大的改善。在不同的治疗方法和患者群体中也观察到了对伪刺激的类似反应，包括严重的抑郁障碍，但到目前为止已经都被归因于安慰剂效应。如果在伪刺激方案中使用的低强度tDCS具有生物活性，其影响可能是深远的。
生理指标可用于客观量化tDCS的调节作用，并评估不同刺激强度的影响。经颅磁刺激(TMS)诱发电位评估的tDCS后运动皮质兴奋性的变化表明，较低的强度(<1 mA)对健康受试者产生更大的影响。然而，这些发现并没有得到一致的结论，目前还不清楚这些结果是否可以推广到DLPFC。来自EEG的神经生理测量可以补充行为测量，并且可能比单纯的行为结果对tDCS引起的工作记忆的变化更敏感。具体地说，使用事件相关电位(ERPs)对工作记忆任务期间的额叶活动进行分析表明，被认为是由DLPFC产生的成分(P3)增加了。因此，这些测量可以用来测试不同的刺激强度能否激活生物学活性。
本研究使用行为和神经生理学方法对健康被试者的电流强度和工作记忆表现的强度-反应关系进行了经验性测试。在先前研究的基础上，假设较高的电流强度会导致更大的认知增强效果，而对tDCS认知效应的meta分析显示，任务绩效和电流强度之间存在正相关。除了没有电流刺激的对照条件外，还评估了两种典型的伪刺激方案，以测试伪刺激能否激活生物学活性。
2 Methods
2.1 被试
共有100名被试被平均分配到5种条件下，采用平行分组、单盲研究设计，每种条件有20名被试。根据基线工作记忆表现，采用分层随机方法将被试分配到每种情况下。
2.2 实验过程
这项研究包括两个实验。
实验1：首先40名被试被随机分配接受2 mA tDCS或伪刺激 (Sham1)。被试完成了一项工作记忆任务，然后是持续约15-20分钟的EEG记录（图1）。对这一数据的初步分析促使使用额外电流强度的第二次实验，以更好地评估tDCS强度的作用，并检查伪刺激的潜在影响。
实验2：60名被试被类似地随机分成三组中的一组：（1）“Off”组，无刺激电流；（2）“Sham2”组，相对于Sham1来说的第二种伪刺激条件；（3）1 mA tDCS。对研究设计中的事件顺序进行了修改，见图1。
图1.实验流程。在实验1中，被试被分配到接受Sham1或2 mA tDCS；在实验2中，被试被分配到接受Sham2、1 mA tDCS，或者在整个实验过程中完全不接受刺激的情况下。灰色虚线表示EEG设置发生的时间，耗时约15-20分钟。灰色实线显示采集EEG的时间。
用4 cm * 4 cm电极(16 cm2)刺激15 min，阳极放在左侧DLPFC(F3)，阴极放在右侧DLPFC(F4)。这种设置已经用于先前工作记忆的tDCS研究中，这与使用对侧眶上阴极定位产生类似的电场大小和分布。电极区域的电流密度大约是使用标准5 cm * 7 cm电极（35 cm2）产生的电流密度的两倍，这与单次tDCS刺激后认知能力的提高有关。1 mA 和2 mA 的tDCS，使用Eldith DC刺激器(Neuro-Conn GmbH, Germany)进行刺激。两种伪刺激分别使用Eldith DC刺激器（Sham1）和tDCS-CT刺激器（Sham2; Soterix Medical Inc., New York）。Sham1刺激在30秒内上升至2毫安，保持30秒，随后30秒下降，然后在off模式下机器默认产生0.016毫安的恒定电流(使用独立电流表验证)。Sham 2的参数是为临床试验预先编程的，该刺激10秒上升到1毫安，随后60秒下降，然后在off模式下的产生0.034毫安的恒定电流。在每个刺激条件下，实验期间输送的电荷总量(毫库仑)为:Off – 0 mC; sham1 - 134 mC; sham2 - 66 mC; 1mA – 930 mC; 2 mA – 1860 mC。视觉3-back工作记忆任务:这项任务要求被试在显示的字母与之前第三个显示的字母匹配时按下一个键(空格键)。工作记忆的表现是用d-prime来评估的，d-prime是一种区分敏感度的衡量标准。反应时只计算正确的反应。被试在主试的观察下练习3-back任务5分钟，以确保他们理解任务。以前的认知测试研究使用交叉设计来最小化个体间差异的影响。然而，考虑到本研究中调查的条件和任务陈述的数量，选择了平行设计来最小化练习效应(即练习对任务的影响)。为了说明基线表现水平的个体差异，被试完成3-back任务后，根据d-Prime表现得分被分成以下三个等级：Low：1.5-2.5, Mid: 2.5-3.5, High:>3.5。分层的截止点是基于先前对tDCS和工作记忆的研究获得的数据。使用TMSi Refa放大器(荷兰)采集EEG数据。脑电帽带着水基电极用于31个EEG记录通道(图2)。考虑到移除tDCS电极并替换为EEG电极会导致实验的显著延迟，因此F3和F4位置仅保留为tDCS电极通道。除Fieldtrip工具箱外，还使用定制开发的Matlab脚本(v.R2016a；MathWorks)进行EEG分析。脑电数据采样频率1024 Hz，并使用带通滤波器(0.5 - 70 Hz)和50 Hz陷波滤波器进行滤波，以去除噪声。使用半自动算法检查数据，去除包含伪迹的epochs。然后使用独立成分分析来去除眨眼和肌电伪影。事件相关电位(ERPs)的计算使用来自3-back任务的所有刺激(包括目标和非目标)，基线校正使用刺激开始前200 ms到500 ms的平均振幅。以前使用类似工作记忆任务的研究已经确定P3是一个感兴趣的成分，结果通常来自额叶中线通道(FZ)。因此，在刺激开始后的220 – 420 ms时间窗口内，通过取FZ电极通道的平均ERPs来提取P3分量的平均振幅。为每种刺激条件创建P3成分的地形图，以观察诱发脑反应的空间分布和大小的差异。
图2 EEG和tDCS电极分布。tDCS电极大小4 cm * 4 cm，阳极放在左侧DLPFC(F3)，阴极放在右侧DLPFC(F4)。使用SPSS 22.0进行分析。基线数据分别使用连续变量和分类变量的单因素方差分析和卡方检验来评估不同条件之间的差异。这包括人口特征(年龄、性别和教育水平)，以及工作记忆任务的基线表现和P3波幅。对工作记忆和神经生理结果进行混合效应重复测量模型(MRMM)分析。得分超过三个标准差的平均值被认为是异常值，被排除在分析之外。在每次偏度和峰度分析之后检查残差，以确保模型参数的充分收敛。将Off状态与Sham1和Sham2进行比较，以确定伪刺激与完全不刺激是否有显着差异。Hedges'g被用来计算效应大小，方法是用平均值的差除以合并标准差。为了检查工作记忆结果，因素包括时间(基线、tDCS期间和tDCS后)、条件(Off、Sham1、Sham2、1 mA和2 mA)、基线表现(从d-素数分层开始的低、中、高三分位数)，以及时间条件交互作用。被试被作为随机因素包括在内。对于ERP分析，由于tDCS期间脑电伪影的存在，只使用了基线和tDCS后的数据。此外，由于实验1和实验2的任务呈现顺序不同，3-back任务中的基线脑电图记录仅适用于OFF、Sham2和1 mA tDCS条件。因此，本文分两个阶段进行了ERP分析。在第一阶段，MRMM分析的因素包括时间(基线和tDCS后)、条件(关闭、Sham2和1 mA)和时间x条件。所有条件的数据仅在tDCS后的时间点可用，因此，在第二阶段的分析中，仅使用条件因子(OFF、Sham1、Sham2、1 mA和2 mA)的单向方差分析来比较这些数据。为了证实行为和神经生理测量检查了工作记忆功能的相似方面，用皮尔逊相关性来测试工作记忆表现(反应时和d-prime)的变化与P3波幅之间的关系。变化分数是通过从刺激后的分数中减去基线分数来计算的。使用来自OFF、Sham2和1 mA条件下被试的综合数据进行相关性分析。最后，使用皮尔逊卡方检验检验被试的猜测(猜测就是最后他们问被试是否自己接受电刺激了，然后被试猜自己受到刺激或者没受到刺激)，对tDCS条件进行盲法检验。对调整后的标准化残差进行事后检验，以确定被试的猜测在某些条件下是否比其他条件下更准确。大于绝对值1.96的残差被认为是显著的。一名被分配到Off组的被试，由于强烈的恶心感觉，在tDCS后停止了实验。因此，Off组样本量减少到19。除在tDCS刺激下(即，在1 mA和2 mA刺激后) 皮肤发红外，实验在其他方面耐受性良好，五种条件下的不良事件比例没有显著差异。年龄、性别和受教育年限等人口统计信息在不同群组之间很好地平衡(见表1)。同样，工作记忆成绩和P3波幅也没有基线差异。表1 被试特征的基线比较。对分类变量进行皮尔逊卡方检验，对连续变量进行单因素方差分析。
对于3-back d-prime分数，时间和基线表现有显著的主效应，条件无显著效应，时间条件交互作用无显著差异。参见图3A为原始分数，3B为估计边际均值曲线图。对tDCS后时间点的简单对比显示，与Sham1或Sham2相比，Off组没有显著影响。对于3-back反应时，时间有显著的主效应，基线表现和条件无显著效应，时间条件交互作用无显著差异。图3C为原始分数，3D为估计边际均值曲线图。对tDCS后时间点的简单对比显示，与Sham1或Sham2相比，Off组没有显著影响。以上分析重复进行，控制了年龄和性别作为协变量，通过验证发现这些因素不会影响结果。
单独的工作记忆原始分数显示为箱图，显示50%的数据分布(z分数范围：-0.675到0.675)，中线标记中间值，黑色菱形表示平均值(图A和C)。工作记忆得分的估计边际平均数来自混合效应重复测量模型分析(图B和D)。T0:基线；T1：tDCS刺激时；T2：tDCS刺激后。在99名样本中，有3名被试被认为是异常值，被排除在所有神经生理学分析之外。MRMM结果显示，对P3平均波幅而言，时间无显著主效应。然而，条件和时间-条件交互作用效应都是显著的(见图4)。对时间-条件交互作用效应的事后分析显示，对于Off组， P3波幅从基线到tDCS后显著降低，而对于1 mA tDCS组，P3波幅有显著增加。对于Sham2组，P3波幅从基线到tDCS后没有变化。tDCS后五组的平均P3波幅有显著差异，见图4B。事后配对检验表明Off-2 mA、Off-1 mA和Off-Sham2均有显著性差异，但Off-Sham1无明显差异。
图4 ERPs。在3-back工作记忆任务的字母呈现(包括目标和非目标)时，在中线额叶通道(FZ)评估事件相关电位。A)实验1的2 mA和Sham1 tDCS条件下的事件相关电位。阴影区域表示用于计算P3分量平均振幅的时间窗口(220-420ms)。B)tDCS后3-back任务呈现时的P3振幅。单个原始分数显示为箱图，显示50%的数据分布(z分数范围：-0.675到0.675)，中心线标记中间值，黑色菱形表示平均值。C)实验2在1 mA、sham2和OFF条件下的事件相关电位。使用来自OFF、Sham2和1 mA条件下被试的组合数据作为基线。阴影区域表示用于计算P3分量平均振幅的时间窗口(220-420ms)。D)根据估计边际平均值计算基线(T0)和TDCS后(T2)的P3。E)tDCS后3-back任务期间所有分组下P3分量的空间地形。与基线水平(图5A-B)相比，P3波幅的变化与tDCS后工作记忆d-Prime的变化相关，但与反应时无关。因此，P3平均振幅的增加与d-Prime的增加有关。Hedges’g的统计数据是通过比较tDCS后时间点的每组状态和Off组状态来计算的，结果显示电生理效应的大小大约是行为结果的两倍（图5C）。
图5工作记忆表现与事件相关电位之间的关系。使用变化分数(从tDCS后得分减去基线计算)的相关性显示：A)判别敏感度指标d-prime与P3平均幅值显著相关；
C)行为和电生理指标在TDCS后比较不同组与Off组的效果大小(Hedge'g)。注：显示d-prime效果大小的相加倒数(即该值的负数)。
被试对tDCS刺激条件的猜测的Pearson卡方检验有显著性意义(表2)。对调整后的标准化残差的事后检验显示，这一显著性主要来自于Off组。在Off组，更高比例的被试正确地推断出他们正在接受虚假刺激。为了探索被试猜测的差异是否可以解释我们的研究结果，我们进行了额外的独立样本t检验，比较了猜测他们收到了主动tDCS(n=35)的被试和那些猜测他们收到了假tDCS(n=64)的被试，无论刺激条件如何，在tDCS后的时间点，每个行为和神经生理结果都是如此。评估的结果没有显著差异。
表2被试盲测。通过让被试猜测他们在实验结束时是处于伪刺激状态(即OFF、Sham1或Sham2)还是处于正常刺激状态(即1 mA、2 mA)来评估致盲的充分性。显著性计算采用皮尔逊卡方检验。Z分数是使用调整后的标准化残差分数获得。
现有的证据表明，tDCS可以产生认知增强，然而，最佳的刺激参数，包括电流强度，仍然是未知的。此外，目前尚不清楚常用的tDCS伪刺激条件是否会产生行为和神经生理效应。在这项研究中，我们使用两种电流强度研究了tDCS，并将两种tDCS伪刺激方案与没有接受任何刺激的Off组进行了比较。不同刺激条件下的工作记忆表现和反应时没有显著差异，这表明行为测量不受tDCS的影响。相反，神经生理学测量显示，Off刺激与1 mA、2 mA、Sham1和Sham2之间存在显著差异，表明伪刺激可能确实具有生物学活性。其中在1 mA刺激产生的效应最大。这表明tDCS强度与工作记忆功能之间存在非线性关系。被试在多个任务演示中的反应时和d-Prime的工作记忆表现普遍改善，这归因于练习效应。但是，我们无法检测到tDCS不同组别之间的任何显著性差异。在3back任务上缺乏显著性差异，这与Hoy等人的发现是一致的。即从行为能力上不存在显著差异，尽管对研究方案进行了修改(即在线刺激和更高的电流密度)，旨在最大限度地发挥tDCS对工作记忆性能的影响。tDCS对工作记忆影响的meta分析显示，刺激后反应时显著改善。虽然显著，但与伪刺激相比，tDCS的改善通常很小，其效应大小为标准化均值差的0.15，并且不同被试之间结果也不相同。我们的数据补充了以前的文献，进一步表明，无论使用的tDCS强度如何，tDCS都不会在健康被试的工作记忆行为表现方面产生实质性的改善。使用Fz通道的P3波幅评估tDCS的神经生理反应有显著差异，统计效应大小(即Hedge'g)大约是使用工作记忆绩效获得的两倍(ERP效应大小从0.64到1.07，而行为测量从-0.12-0.50；图5C)。P3分量被认为是由至少两个子分量生成的。早期的子成分主要产生于额叶，如DLPFC和前扣带皮质，并参与注意过程。后一子成分产生于顶叶皮质，与认知资源注意力重新分配后的工作记忆更新和处理有关。先前已经观察到工作记忆表现与P3成分之间的相关性，除了工作记忆负荷之外，还包括枕部P3振幅、错误率和反应时之间的负相关。尽管缺乏对工作记忆表现的显著研究结果，但观察到神经生理结果与d-prime呈正相关。这表明，平均而言，P3增幅最大的被试在工作记忆表现上的改善也最大。一些项目组研究tDCS应用于运动皮质的刺激强度-反应关系，结果并不统一。最近一项关于tDCS对皮质脊髓兴奋性影响的meta分析发现，小于1 mA的电流强度比较高的电流强度产生更大的影响。类似地，Hoy 等人研究了前额叶刺激对工作记忆成绩的影响，发现使用1 mA而不是2 mA或伪刺激的2-back任务有显著改善。越来越多的证据表明tDCS的刺激强度-反应关系是非线性的、倒U形的。本研究的神经生理学结果似乎与这发现一致，1 mA刺激对P3波幅的影响最大。因此，在对健康被试进行tDCS的未来研究可能会受益于使用接近1 mA的刺激强度。尽管没有进行正式分析，但在tDCS测试的最高强度下，神经生理反应似乎有更大的个体差异性(图4B)。神经影像研究同样显示，与伪刺激相比，阳极tDCS后静息状态功能连接模式的变异性更大。这些观察结果被认为是由于个体对tDCS反应的差异造成的。例如，对tDCS诱导的皮层兴奋性的测量表明，TMS敏感性可以预测对刺激电流强度的反应。多种因素可能影响tDCS反应，包括生理参数，如神经递质可用性和受体分布，以及个体解剖特征。在未来的研究中，个体的MRI扫描可以用来生成解释解剖差异的个性化电流密度场模型，从而可以根据感兴趣区域内估计的有效电场密度预测最佳刺激参数。有趣的是，P3波幅在伪刺激条件下和Off状态下有显著差异，表明伪刺激条件下的tDCS可能会改变神经活动。值得注意的是，同样的伪刺激条件(即Sham2)被用于一项关于tDCS对抑郁症疗效的多中心试验，结果发现，与积极治疗相比，经过几周的伪刺激后，患者情绪有了更大的改善。总之，这些发现强调了进一步探索tDCS伪刺激方案潜在影响的必要性，因为我们的发现有几种可能的解释。首先，被试能很好地识别Off状态，因为没有电流刺激。所以，有可能在Off状态下没有感官刺激，降低了分心程度，使被试能更投入到任务中来。任务投入的提高可以增强练习效果，从而限制了与tDCS不同组别检测出显著差异的能力。然而，我们观察到，在那些猜测他们接受了伪刺激的被试和那些猜测他们接受了真正tDCS的被试之间，结果并没有显著的差异。有证据表明，施加持续几个小时低至0.02毫安的电流强度，可以对抑郁症状产生有益的影响。在本研究中使用的两种伪刺激输出测量表明，它们在斜坡下降阶段提供了类似强度的背景电流(Sham1: 0.016 mA; Sham2: 0.034 mA)。尽管这些电流非常低，但在整个实验过程中，结合斜坡上升/下降阶段，它们可能会产生足够的电荷来改变神经活动(Sham1:134.4 mC; Sham2: 66.3 mC)。目前，一些研究试验采用低强度tDCS(<0.5 mA)作为伪刺激，基于计算机模拟数据，表明低电流不会改变神经活动。因此，如果本研究中发现的伪刺激的神经调节作用得到证实，tDCS领域的研究可能需要新的假盲方法，以获得与主动刺激更准确的比较。这些措施可能包括事实上的掩饰，即告知被试将接受主动刺激，感觉上的副作用只有在极少数情况下才会发生，或者开发完全通过皮肤而不是通过脑组织的新型电极。最后，我们的结果暗示，脑电指标可能是由于tDCS引起的神经改变的更敏感的标志，正如在过去的研究中已经注意到的那样。检查工作记忆的任务评估了几个认知过程的功能，包括注意力重新分配、编码、提取和更新。因此，行为结果反映了这些过程的综合结果。然而，ERP组件可以充当各个处理阶段的标记，例如P3反映了注意力和记忆更新。如果tDCS选择性地调节其中一个阶段，那么捕捉它们的神经生理学测量将比综合行为结果更敏感地检测tDCS的影响。因此，通过识别受影响的过程，评估神经生理指标也可能有助于理解tDCS的作用机制。未来的研究应该在可能的情况下纳入神经活动的类似测量，以补充行为结果。在测试的五种刺激条件下，工作记忆表现没有差别。因此，在健康被试的工作记忆增强的情况下，不能推荐最佳的电流强度。神经生理学测量结果显示，主动刺激条件下与无刺激条件下、伪刺激条件下与无刺激条件下有显著差异。因此，tDCS伪刺激可能是一种生物学上积极的干预措施，因此在tDCS研究中可能需要新形式的被试盲法，以允许与真正的安慰剂反应进行比较。
