本文中所有的受试者均是参加早期神经退行性改变的风险因素的图宾评估的前瞻性研究的参与者。该队列研究涵盖的参与者是基于嗅觉丧失，抑郁或者可能存在的RBD，这些增加了PD风险，极大了丰富了该队列研究。在过去的十年间，对1202名患者进行了综合性评估。在第三次随访时收集粪便样本，并且与相应的评估相关联的标记物和风险因子。粪便标本使用含有DNA稳定剂的收集管，由邮政快递服务提供，在收到后立即冷存并储存在-80℃。样本来自于745名参与者。其中，排除了47名使用了抗生素的志愿者，11例已罹患PD，2名患有非典型或者继发性帕金森综合征，3名患者为帕金森氏症，以及16名志愿者丢失了其饮食和治疗数据，总共使用666名志愿者的数据进行统计分析。根据最近更新的MDS前驱PD研究标准，共选择了9种风险和9种前驱症状标志物，并对其与微生物指标的相关性进行了研究我们评估了以下PD风险标记物：男性，黑质高回声(经颅超声)，不吸烟，不喝咖啡(每天的杯数)，PD家族史阳性(一级亲属)，体育活动(即低活动水平，测量标准使用运动小时/周)，2型糖尿病(诊断)，职业溶剂和农药暴露(患者自述)。前驱症状包括嗅觉丧失(嗅探棒，16SS)，抑郁(急性或已诊断为终身)，便秘(Rome-III标准，总评分)，可能的RBD(RBD筛查问卷)，日间过度嗜睡，勃起和排尿功能障碍，症状性直立性低血压(如前面所描述，后三种使用UMSARS问卷评估)。此外，运动障碍表明阈下帕金森病，采用MDS-UPDRS-III (排除动作/姿势震颤项目后，分数>6分;从3到6分被定义为临界运动缺陷。此外，还考虑了90个其他变量，包括:
1、在统计分析中筛选了80个变量作为调整的潜在混杂因素7个通用/生理变量(例如年龄、身体质量指数(BMI)、受教育程度和爬三层楼梯导致的疲劳感[不可以，可以，无法一次性爬三层])肠道功能相关的五个变量(如肠易激综合征、腹胀、呕吐/腹泻)16个与饮食相关的变量(评估每周的肉类、蔬菜、乳制品、蛋白质、碳水化合物和酒精消耗量)2、探索性变量进一步测量前驱PD的其他方面或代表性替代物（仍很少被承认）根据MDS针对PD前驱症状的研究标准，被诊断为前驱症状PD的可能性(>50%概率)和可能的前驱症状PD(>80%概率)的诊断的计算都是基于年龄和综合个体标记谱计算的。探索性替代组/风险因子定义/前驱标记物包括：3个便秘相关的变量，2个吸烟史变量，以及2个运动等级变量。关于18种风险和前驱症状标记物和另外90种变量的完整列表、它们的具体评估方法、变量定义和描述性统计，请参见支持性材料。研究调查了18种单一风险和前驱症状标记物与不同微生物指标的可能关联性。为了研究这一主要目标，我们考虑了80种不同的混杂因素，以调整风险和前驱期标记效应。此外，测量PD的其他方面的10个变量(如前驱PD的概率)或其他标记分组/定义作为探索性变量进入分析(上文已提到并在支持材料中列出)。该研究采用了两阶段的统计分析方法。首先,在预审阶段,18个风险因素中的每一个因素，每一个前驱的标记以及90个额外变量的每一个变量都分别进行了测试(特定测试见下文)，与菌群不同方法间的联系(菌群α-多样性、β-多样性，肠型)。因此，这里是显示标记物/变量效应p值小于1，p<1被选择用来随后的多因素统计建模。从便秘、吸烟、运动功能的多重测量中选择p值最低的变量。预筛步骤的结果在支撑材料中显示。第二步，将所有选择的风险和前驱症状标志物及其他混杂调整因子纳入多因素统计模型，并进行模型选择，最终模型仅由标志物/因子组成，显示边缘效应的p值小于1(支持材料中加粗的p值:单变量关联)。因为这项研究的主要目标是18风险和前驱的标记物(已在预筛步骤进行过测试),的关联测试，Bonferroni-corrections n = 18测试应用于多因子的测试, 和这18个标记物的修正影响阈值为p<0.003。对于调整因子，没有进行对多重测试进行校正(p<0..05)。在肠型分析中，对所有三种肠型组之间的差异进行事后两两比较的统计检验，并相应地在多次测试校正后，p值小于0009被认为是显著的。进行了α-多样性的线性多元回归分析。标记物/风险因素与β-多样性的关联使用PERMANOVAs(单变量:adonis,多变量：adonis2，命令均从R包vegan获得)进行分析。此外,α-和β-多样性检测运动，其他风险，PD前驱的标记物之间的相互影响。采用Fisher s确切检验和KruskalWallis检验对不同肠型之间的标记/因子差异进行检验，随后采用以肠型为因变量的多项logistic回归进行多因素分析。对于差异丰度分析，使用了DESeq2，这是一种基于负二项分布的广义线性模型(序列计数数据)的方法。DESeq2模型包括所有共占最后测定β-多样性的 PERMANOVA模型的协变量，p值针对多个测试进行调试，这些测试使用的是FDR修正为了检测的不同分类单元的数目不同。我们使用R (v3.5.1)进行所有的分析和图形。使用图宾根大学的REDCap电子数据采集工具趋势研究数据的收集和管理。趋势研究中的样本年龄为：68.4±6.3岁 （53-86）。风险和前驱标记物变量显示出一下描述性数据，即各因素在666名参与者中所占比例：男性（52.7%），黑质高回声（21.6%），阳性家族史（14.7%），体育锻炼（不锻炼（25.7%），每周少于1小时（30.9%），每周1-2小时（24.2%），每周2-4小时（8.3%），每周大于4小时（10.4%）），不抽烟（从不（6.8%），已戒烟（46.7%），目前抽烟（46.5%））；不喝咖啡（14.4%）；2型糖尿病（8.3%），职业溶剂暴露（10.8%），职业杀虫剂暴露（1.3%），嗅觉丧失（19.7%），抑郁（31.5%），便秘（严重性评分：3.1 ± 3.9，分数区间：0-25），可能的RBD（12.6%），白天嗜睡过多（3.8%），勃起障碍（21.5%），排尿障碍（5.1%），体位性直立性低血压（4.7%），运动失调，无运动缺失（90.5%），阈下震颤麻痹（3.5%）。基于前驱PD可能性(3.8 ± 11.4%, 0.0 - 89.1%)，有15名被诊断为可能的前驱PD，5名是极有可能的前驱PD。在粪便样本中最重要的菌群是Bacteroides，随后是Faecalibacterium,Gemmiger, Roseburia, Prevotella and Ruminococcus （图1）。
图1:10个最常见的细菌丰度，此图结果显示，种群丰度一Bacteroides最为丰富。
2 α多样性
属水平上的α-多样性由逆辛普森指数显示同两个风险标记,一个前驱症状,以及四个额外的调整因素有关(表1)。总的来说,多元回归模型解释α-多样性方差(R2)的8.0%。便秘严重程度和年龄与α-多样性或许呈正相关,而体力活动(图2A)和职业接触溶剂以及摄入甲状腺药物是降尿酸药物和爬楼疲惫感 (图2 B)与α-多样性呈负相关。选中的变量没有在α-多样性上显示同体育锻炼有关（p>0.1）。运动障碍没有发现同α多样性具有关联（p>0.1），运动障碍同体育锻炼间也没有显著性差异（p=0.088；图2C）。
表1：α多样性同风险因子，PD前驱期标记物，以及其他因子之间的关系，矫正后p值以0.003为基准，以*表示，未进行校准的使用0.05的标准，使用（*）表示。α的多样性同体育锻炼，职业溶剂暴露，便秘，年龄，爬楼疲劳测试，降尿酸药物，甲状腺药物的使用有明显相关性，而与阈下帕金森病无关。
图2：α-多样性和身体运动。每周不同活动强度下（A），锻炼后疲劳程度（B），不同运动缺乏群体中的锻炼水平（C）下的α-多样性
3 β多样性
通过β-多样性可知，样本之间在菌群构成上的差异同多种风险和PD前驱标记物有显著性关系。（表2）除了年龄（图3A），体育锻炼（图3B），便秘（图3C），以及BMI解释了大部分变异（R²）。此外，性别，吸烟，可能的RBD，不同药物，食用全麦面包都同β多样性有关。然而运动失调没有关联，体育锻炼和运动失调之间的联系解释了在β多样性上的变异（p=0.002）。
表2：β多样性同风险因子，PD前驱期标记物，以及其他因子之间的关系
图3：因子的二维空间的NMDS量表显示出明显的Bray-Curtis距离差异。显示出不同年龄组（A）、不同体育锻炼水平（B）、以及便秘严重程度（C）之间的菌群差异。圆圈表示了95%置信区间。
4 肠型
拟杆菌丰富的菌群构成（样本占比70.9%）通常和普氏菌丰富（21.5%）和厚壁菌（7.7%）丰富的肠型进行对比。肠型不同，有不同的风险因子，前驱标记物以及其他因子（表3）。例如，厚壁菌丰富的肠型人群，很少体育锻炼，便秘很严重（图4A 和4B）。体育锻炼较频繁的人群通常是拟杆菌丰富（图4A）。普氏菌丰富的人群便秘程度最轻，阈下震颤障碍发生频次最低（图4B 和4C）。
表3：肠型同风险因子，PD前驱期标记物，以及其他因子之间的关系
图4：肠型在以下分组表现出了显著性差异：（A）体育活动水平的比例，（B）便秘的严重程度，（C）存在可能阈下帕金森症运动障碍的患者比例。*表示在进行Bonferroni矫正以后具有显著性差异（p<0.0009）,(*)表示未校正前效应为p<0.05.
5 丰度差别
一些同β多样性相关的变量也同特定的类群丰度有关（支持材料；所有的p值已经过FDR修正）。类群差异度最丰富的的变量是便秘（表4）。在属的水平上，同PD相关的之前的分类单元之外，随着便秘程度的增加，类杆菌属丰度也下降，p=0.022，氏菌属丰度也下降，p=0.008，体育疲劳伴随着双歧杆菌的丰度下降，p=0.039，可能的RBD与乳酸杆菌下降有关，p=0.023.此外，运动缺损显示，阈下震颤麻痹同Odoribacter下降相关，p=0.031。进一步研究显示，可能的RBD同类杆菌属和食物谷菌的下降具有相关性，均为p=0.017，也同嗜血杆菌的风度增加具有相关性，p=0.003。降尿酸药物的使用同梭菌属以及Parasutterella丰度较高具有相关性，分别为p=0.005和p=0.032。Prevotella和 Akkermansia在以上任何差异度分析中均没有统计学意义。
表4：在多因素模型中，与PD相关的前驱期标记物以及多种风险相关的不同分类下差异度。
本研究调查了666名老年人肠道微生物组成、帕金森病风险标记物和前驱症状标记物、阈下震颤麻痹以及各种潜在混杂因素之间的关系。在这些标志物中，特别是体育锻炼、便秘、可能的RBD、吸烟和阈下震颤麻痹与微生物群落组成的改变有关。此外，年龄、性别、职业性溶剂暴露、阈下震颤麻痹与体力活动的相互作用与不同的微生物指标有关。如我们所预期，个体标记物和风险因子的效应 (小于1%解释方差)和多因子模型的效应大小(约8%)较小。所有微生物指标均与黑质高回声、嗅觉丧失、抑郁、直立性低血压、泌尿/勃起功能障碍、PD家族史或基于个体标记谱计算的总体PD前驱症状概率无关。细菌类群的相对丰度与其他健康老年人个体的相对丰度基本一致。与以前的研究结果相比，Bacteroides的相对丰度较低，这可能是由志愿者招募、人口统计、区域和/或生活方式等因素导致的队列组成差异造成。就菌群α多样性而言，年龄、便秘和缺乏体育锻炼同α多样性增加有关，而增加溶剂和职业暴露同α多样性减少有关。同正常人群相比，PD患者均有更高的α多样性，这是已被证明的结论，然而总体来说各种证据的结果并不一致，而且目前尚不清楚α-多样性和PD是否有联系的。与我们的研究结果相似， 在老年群体中，年龄越大，α-多样性较高。然而，这种效应的对的构建是很复杂的，疾病，药物治疗，生活方式的改变常常和老年有关。对于便秘，较高的α多样性同粪便一致性困难以及功能性便秘有关。与PD发生相关的自主神经功能障碍可会对α多样性产生作用，但是需要同诸如饮食，粪便含水量，转移时间，菌群增长率等潜在的影响因素分开。缺乏体育锻炼增加了诸如PD一类的慢性疾病发生的风险；相反地，积极运动或许会减少PD前驱症状的发生，比如，便秘。缺乏活动的影响可能与在帕金森病中观察到的病程有关，即结肠炎症增加、免疫应答和肠道屏障通透性。爬楼梯产生的疲惫程度，代表低心肺适能的一个指标，与减少α-多样性有关，与先前的研究表明低多样性可与易疲劳相关。这一明显矛盾的结果可以部分解释为体力活动和能力之间的差异。此外,PD风险标记物职业溶剂同α-多样性下降有关。风险和前驱的标记物在微生物组成上的作用或许是基于潜在的病理生理途径，或许可以解释为什么基于综合标记物谱的前驱期PD对的计算显示出同α多样性并没有关系。β多样性始终显示PD患者和对照组之间是不同的。几个PD风险因子和前驱期标记物即使在考虑了多种混杂因子的多因素模型中也同β多样性有关。这些发现说明在PD的前驱期，菌群就已经发生了改变。尽管α多样性同β多样性之间并没有直接关系，而便秘和缺乏体育锻炼解释了大部分变异。尽管体育活动和缺乏运动并没有显示出同α多样性有显著性差异，他们却显示出同阈下帕金森症有明显的相互作用，并与β多样性有关，因此，样本之间菌群的差异性取决于多因素之间的相互作用。这些相互联系在PD前驱期起到了怎样特殊的作用仍然值得探究。β多样性和可能的RBD，性别还有吸烟之间的关系进一步支持了PD发生过程中的菌群改变。在重复糖尿病的治疗，使用β受体阻滞剂的效应研究，我们的研究发现，对降尿酸的药物的研究，α多样性和β多样性以及丰度差异具有最高的一致性。尿酸盐是一种有效的抗氧化剂，有助于降低PD发生的风险。我们实验结果显示，肠道菌群有潜在作用。全麦面包是唯一与β多样性有关的膳食因素。全麦面包被看做是高纤维消耗的指标，并且更好的保证肠道完整性和SCFA的产生。由于肠道屏障完整性和SCFA的生成均在PD发生过程中被破坏，并且，他们对鱼菌群-肠道-大脑轴中间的许多过程有着影响，因此，饮食也或许会影响PD前驱期。在体力活动，BMI解释了大多数β多样性的差异。对于一些同BMI相关的饮食因素，其独立效应可能较小，达不到统计学意义。与富含Firmicuts的肠型相比，富含Prevotellaa的个体很少出现阈下帕金森症。与对照组相比，这一发现与PD中Prevotella的丰度降低一致，在进展性的PD更严重。因此，本研究支持Prevotella在前驱PD中的相关性。便秘引起的微生物变化常被争论为混淆了PD患者的微生物组分析。富含Prevotellaa的肠型在便秘严重程度高的个体中也是最不常见的。根据先前的研究结果，得分高的受试者通常具有富含Firmicuts的肠型。将帕金森病患者的便秘与紊乱的肠神经系统联系起来，显示出与受影响的大脑结构相似的细胞变化，这可能意味着Prevotellaa与前驱症状的自主神经功能障碍和运动功能障碍有共同的相关性。因此，便秘可能不是混杂的，而是反映了一种常见的致病过程。尽管通过一些可能的机制，便秘对菌群产生了影响，同健康个体相比，这些影响在患病个体上产生的效果是不一样的，正如最近在PD中所揭示的，α多样性和粪便一致性之间的关系。运动不足在富含Firmicuts的肠型个体中更为常见，而富含Bacteroids的肠型在常体育锻炼的个体中更为常见。虽然与从人类和小鼠研究中获得的一些证据相一致，但体育锻炼、其他前驱症状标志物、肥胖、营养和微生物组成之间的联系过程是复杂的，需要进一步研究。差异丰度分析的结果与以前的发现部分一致，但一些报道的PD和RBD的分类单位与风险和前驱标记没有关联。与肠型分析相比，未观察到显著的Prevotellaa丰度差异效应，这可以部分解释为协变量的差异。在其他候选属中，Akkermansia与任何风险和前驱症状标记均无显著相关性。然而，可能的RBD表现出几个差异丰富的类群，这些类群以前没有与PD或RBD相关联 (Faecalicoccus, Victivallis和嗜血杆菌)。乳酸菌在可能患有RBD的个体中减少，而PD患者中乳酸菌反而增加已被反复证实。PD的前驱症状的亚型可能不同程度的存在于肠道(例如，RBD代表早期自主神经去神经的一种亚型)。此外，随着时间的推移，微生物组可能(不同地)发生变化，即从前驱症状到临床确诊的PD，菌群会发生变化。这种复杂性可能会妨碍与PD(前驱症状)相关的微生物群特征。然而，这些特征可能允许基于微生物组(以及潜在的或固有的病理)对个体进行早期分层，以及早期和有针对性的治疗干预。便秘严重程度与Faecalibacterium和Blautia的丰度降低显著相关，产生SCFA的菌群对肠道黏膜有积极作用，但是在PD中降低。Odoribacter在具有阈下帕金森病个体中的减少的发现与前驱症状有潜在的相关性。Odoribacter是同SCFA的生成，色氨酸代谢息息相关的菌群。它或许同胃肠道完整性，色青素源性肠功能障碍（延长的传送时间）以及中枢神经系统功能障碍（焦虑）相关，以上是通过小鼠的自闭模型得出。（1）一些标记物，饮食以及用药情况的数据是由志愿者自行评估汇报。虽然这些评估是结构化和高度标准化的，但定量测量或获取医疗记录可能更准确，例如用于评估体育活动、饮食和药物。(2)相互作用分析仅限于涉及体育活动的分析，因为体育活动与帕金森病风险标记和帕金森病前驱症状标记相关。对标记物和群集相互作用以及潜在偏差的潜在因素需要进行进一步的研究，以更好地模拟微生物关联的复杂性。(3)粪便标本不是在排便后立即冷冻，而是在邮寄后冷冻，冷冻的延误可能构成技术上的混淆。然而，收集管中含有DNA稳定剂，延迟冷冻对微生物组成的影响应该是最小的。(4)部分风险和前驱症状标志物出现的频率较低，且较低的统计能力可能导致了一些非显著性差异。总之，PD的一些风险因素和前驱的标记，特别是运动相关的标记和便秘，与微生物α,β-多样性改变，肠型改变，以及菌群丰度变化有关。便秘、体育活动、可能的RBD、尿酸水平、吸烟和阈下帕金森病可能与帕金森病的前驱症状期的菌群相关。然而，许多其他预测PD的指标和总体前驱期PD的发生概率值显示，他们与任何微生物测定均没有显著相关性。前驱期的微生物变化可能只是在具有特定标记的亚群中可观察到的。这些标志物和相关微生物群在肠道通透性、粪便免疫介质、结肠炎症和与宿主机体的系统相互作用方面的功能需要进一步研究。对帕金森前驱期菌群的研究，针对帕金森诊断的微生物群动态改变以及与PD前驱期相关的病原学研究，都应建立在对PD病例的前瞻性的标记物图谱分析和多组学数据研究的基础之上。
