科研 | Molecular Systems Biology：大肠杆菌中枢代谢中蛋白质-代谢物相互作用的系统图
编译：Jione、song，编辑：十九、江舜尧。
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细胞的活性和适应性来自多种生物分子的动态调节相互作用。与代谢物的相互作用作为许多调节蛋白（例如转录因子和激酶）的信息输入，显得尤其重要。广泛的蛋白质-代谢物相互作用网络可以协调每个细胞中的各种活动。对这些功能性相互作用的了解主要基于对单个蛋白质的研究积累的生化证据，这些蛋白质一般在现有知识的基础上通过测试化合物来产生一些新的相互作用。尽管在蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用网络的系统定位方面已取得了长足的进步，但蛋白质的系统定位代谢物相互作用的研究滞后。为了解以及验证代谢物与蛋白质的相互作用，研究人员基于先前已有的知识深度，选择了特征鲜明的大肠杆菌中央代谢作为研究对象，使用配体检测的NMR，检测了29种酶与55种细胞内代谢物的结合事件。结果检测到98种相互作用，其中嘌呤核苷酸占三分之一，而所有代谢产物中的50％不与任何酶相互作用。相反，只有5种酶没有任何代谢物结合，有些酶最多与11种代谢物相互作用。由于与目标反应物的化学相似性低，预计约有40％的相互作用代谢物是变构效应物。对于8种相互作用中的5种，体外测定证实了新的调节功能，包括对第一个戊糖磷酸途径酶的ATP和GTP抑制作用。结果表明有关蛋白质-代谢物相互作用的可用信息可能较少。
论文ID
原名：Systematic mapping of protein-metabolite interactions in central metabolism of Escherichia coli
译名：大肠杆菌中枢代谢中蛋白质代谢物相互作用的系统图
期刊：molecular systems biology
IF：9.8
发表时间：2019年7月31日
通讯作者：Yaroslav Nikolaev ＆ Uwe Sauer
通讯作者单位：苏黎世联邦理工学院分子系统生物学研究所＆瑞士苏黎世联邦理工学院分子生物学与生物物理学研究所
实验设计
结果
1 配体检测的T1rho NMR生物子网分析
为了深入探究目前在大肠杆菌中枢代谢中蛋白质-代谢物相互作用的知识，实验人员选择了所有单体酶和同源寡聚酶。由于预期的纯化和体外重构困难，排除了异源寡聚体和膜结合蛋白。对于由一种以上的酶催化的反应，选择了主要的同工酶。通过His-tag亲和纯化从ASKA文库的克隆中纯化得到的35种选择的中枢代谢酶。对于其中的6种酶（AceB，GltA，Ppc，PpsA，PrpC和SthA），在高通量纯化条件下仅产量较低，将最终酶降低为29种酶。
为了对假定的调节剂进行系统测试，从几种途径中选择了59种代谢物，包括氨基酸、核苷酸、辅因子和中枢代谢，其中几种具有已知的调节功能。在最初的59种产品中，由于缓冲液和温度条件下不稳定，因此未测试四种代谢物（辅酶A、乙酰辅酶A、赤藓糖4-磷酸酯和5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸）。为了检测蛋白质与代谢物的相互作用，将纯化的蛋白质与一部分代谢物混合，并记录NMR光谱。单个一维（1D）NMR光谱可以解析几十个单独的代谢物信号。由于小分子和大分子的NMR特性不同，蛋白质结合后代谢物信号变宽（强度降低）。利用信号强度的这种变化来检测代谢物与蛋白质的相互作用。高通量NMR分析依靠特定代谢物混合物的NMR光谱中分离的化合物特定峰的可用性。随着代谢物混合物的复杂性增加，NMR信号开始重叠，从而限制了可以在一种混合物中可靠地测定的代谢物的数量。为了将选定的代谢物分成最小数量的组（混合物），使用了NMRmix工具。将三种代谢物明确分配给不同的混合物以避免潜在的酶促反应，从而产生四种混合物，每种混合物包含12、14、14和15种代谢物，以使每种代谢物在1D 1 H NMR光谱中均具有至少一个良好分离的信号混合物（图1A和B）。
为了自动进行数据采集，研究人员开发了一组基于Python的TopSpin库，用于样品更改，基本实验设置和光谱处理。与先导研究相比，为了提高测量通量，仅测量了1D氢检测（1 H）T1rho弛豫谱，而省略了通过梯度谱（WaterLOGSY）观察到的水配体，因为前者似乎更稳定，但敏感性稍差。结合大量大分子靶标后，Tlrho实验检测出代谢物中的信号衰减率（松弛率）。如果代谢物和目标之间存在相互作用，则代谢物的NMR信号会更快地衰减（消失）。为了使代谢物不稳定性对最终光谱中信号的影响最小化，在弛豫时间长（200 ms）的T1rho实验之前和之后，将弛豫时间短（10 ms）的Tlrho光谱测量为两个相同的重复。此外，两个短时T1rho光谱的差异光谱提供了一种高质量的过滤器，可检测在特定蛋白质存在下显示出化学不稳定性增加的代谢物。在其他不稳定因素中，代谢产物的降解可能是酶促转化的结果，尽管考虑到蛋白质-代谢物混合物在NMR记录前要孵育几个小时，但这不太可能成为主要的混杂因素。但是，鉴于当前的设置，区分代谢物不稳定的各种来源是不可行的。为了鉴定蛋白质与代谢物之间的相互作用，将纯化的蛋白质与过量的四种代谢物混合物（15 lM的蛋白质单体和200 lM的每种代谢物）分别混合在针对生理盐浓度优化的缓冲液中（图2）。
酶和代谢物之间的相互作用使用全自动定制分析管线进行分析，首先通过计算分数信号强度和松弛因子。对于最终分析，选择了ΔRF度量，因为它对给定的蛋白质和代谢物组给出了更好的结果（通过比较两个度量的“曲线下面积”进行评估；附录图S5）。ΔRF度量可量化单独代谢物和存在蛋白质时信号松弛率的差异。如果存在代谢物和靶标之间的相互作用，则差ΔRF值会增加到零以上。
在采用NMR设置的情况下，通常可检测到离解常数（KDs）在μM至mM范围内的相互作用，其中1M KD产生的代谢产物信号衰减最强。蛋白质的存在，即最高的DRF。在蛋白质-代谢物混合物的最终T1rho NMR光谱中（排除纯蛋白质和代谢物信号后），此处使用的最终分析仅限于信噪比大于2的峰。
图1 代谢产物混合物的核磁共振谱
图2 配体检测核磁共振方法的工作流程
2 大肠杆菌中枢代谢物中蛋白质-代谢物相互作用的系统图
为了确定代表生物学相关相互作用的DRF值，研究了检测到的相互作用与EcoCyc数据库中报道的已知相互作用的重叠。在这29种酶和55种代谢物中，已知有43种催化作用（代谢物是底物或产物）和40种调节作用（代谢物改变了酶的活性）。由于某些调节代谢物也是其靶酶的底物或产物，因此具有72种先前已知的相互作用。使用不同的DRF截止值，计算了恢复已知相互作用的假阳性率和真实阳性率，获得了接收者-操作者特征曲线。对于保守发现（仅选择高可信度的交互作用），选择5％的假阳性率，对应于所有后续分析中应用的DRF截止值0.1805。
通过应用5％的假阳性率临界值，在数据集中检测到98种不同的蛋白质-代谢物相互作用。恢复了先前报道的72种相互作用中的22种（30％），因此实现了比最近基于MS的研究高两倍的真实阳性率（已知相互作用的恢复率为16％）。测试的55种代谢产物中有一半没有任何相互作用，另一半平均与3.5种蛋白质发生相互作用（图3A）。值得注意的是，在测定中，20种蛋白原氨基酸中只有4种（Asn，His，Leu和Trp）表现出与被测酶的相互作用。相反，十种受试的核苷酸相关代谢物与36种酶相互作用，最突出的是GTP与13种酶相互作用，而AMP与9种蛋白相互作用。总体而言，此处检测到的相互作用在调节相互作用和催化相互作用之间均等分布（图3B），这表明NMR方法不受相互作用类型的影响。同样，如NMR T1rho弛豫实验所预期的那样，由于相互作用涵盖了广泛的代谢物，因此似乎没有通过化学结构产生偏倚。仅五个测试的蛋白质不与任何代谢物相互作用，而其余的24个蛋白质平均与约四个代谢物相互作用。连接最紧密的酶是果糖二磷酸醛缩酶（FbaA）和苹果酸脱氢酶（MaeB），每种酶都有11种相互作用的代谢物。将新检测到的相互作用投影到中枢代谢网络上显示，三羧酸（TCA）循环中的相互作用显着减少（图3C）。研究人员观察到催化可逆或不可逆反应的酶之间无显着差异。每个蛋白质相互作用的代谢物的数量与蛋白质大小无关，表明实验结果不受靶分子分子量的影响。序列水平分析显示蛋白质脂族含量和亲水性与观察到的显着命中数没有相关性。同样，代谢产物的疏水性与检测到的相互作用数无关。总共发现了76种新的蛋白质-代谢物相互作用。
图3 核磁共振检测酶-代谢物相互作用的研究进展
3 化学相似性区分潜在的变构相互作用和竞争相互作用
对于催化相互作用，结合必须发生在酶的活性位点。对于调节相互作用，结合可以发生在活性位点（竞争性调节）或替代结合位点（变构调节）。这样的变构调节剂通常具有更强的调节潜力，因为它们的作用通常并不很大程度上取决于酶天然底物的浓度（例如，在非竞争性抑制的情况下）。为了区分结合模式，科研人员研究了代谢产物与受试酶的底物和产物的化学相似性。假设竞争性粘合剂与别构粘合剂相比，与底物或产品的相似性更高。为了研究生物学子网络中化学相似性的潜在分布，使用Simcomp2计算了所有可能的调节剂-底物/产品对之间的最大全局化学相似性。Simcomp2使用基于图的方法识别两个化学结构的最大通用子结构（Hattori等，2010）。所得分布范围为零（无相似性）到一（完全相似性；调节剂与底物或产品相同），平均值为0.34。计算此98种检测到的相互作用的度量标准，得出的分布平均值为0.59（图4），这意味着大多数NMR检测到的相互作用物与其靶标的天然底物/产物相似（> 0.5）。反过来，这表明许多检测到的相互作用是由于代谢产物与酶活性位点的结合所致。尽管如此，仍有40％的NMR检测的相互作用物与目标酶的底物/产物具有较低的化学相似性（<0.5），这表明其构象结合模式（图4B）。由于氨基酸和核苷酸相互作用体距离中央代谢的距离更远，因此它们在假定的变构结合物中占主导地位（图4A，黑色矩形）。总体而言，预测在76个新发现的交互中，有36个是变构的，而其余的交互具有竞争性绑定模式。
图4 大肠杆菌中央代谢过程中酶-代谢物相互作用的图谱
4 借助体外酶测定法验证新预测的蛋白质-代谢物相互作用
鉴于NMR在检测分子相互作用中已确立的可靠性，研究人员决定直接在功能水平上验证新预测的相互作用。为了验证预测的功能，基于它们的生物学相关性和化学相似性选择了八对酶-代谢物，并在存在和不存在预测的调节剂的情况下，通过体外测定测试了酶的活性。首先，选择NADP +依赖性葡萄糖6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Zwf），其位于糖酵解和戊糖磷酸途径之间的分支点。基于NMR的方法预测Zwf与核苷酸ATP、GTP和IMP的相互作用，其与天然底物/产物的化学相似性分别为0.60、0.55和0.44。这些相互作用在EcoCyc或BRENDA中没有报道，除了在没有稳定的Mg2+离子的情况下，ATP对Zwf的抑制作用之外。在基于板读数器的体外酶分析中，即使在生理浓度的MgCl2中，ATP和GTP的确抑制Zwf。IMP不影响Zwf活性，类似于阴性对照AMP（图5A）。其次，调查了L-色氨酸和苯丙酮酸对磷酸乙酰基转移酶（Pta）的预期调控。选择这些相互作用是由于调节剂与酶的天然底物和产物之间的相似性非常低（0.06和0.05），表明可能存在变构相互作用。基于质谱的体外试验显示苯丙酮酸的浓度依赖性很小，但微不足道，但L-色氨酸对磷酸乙酰转移酶活性没有抑制作用（图5B）。第三，糖酵解果糖-二磷酸二醛缩醛醛糖酶II类（FbaA）在EcoCyc中没有报道的代谢物调节剂，但被发现与11种代谢物相互作用。我们选择3-磷酸甘油酸，ATP和磷酸烯醇丙酮酸进行验证，以及次黄嘌呤和IMP作为阴性对照。基于质谱的体外试验表明3-磷酸甘油酸，ATP和磷酸烯醇丙酮酸对酶具有激活作用，而次黄嘌呤和IMP没有可测量的影响（图5C）。以前，据报道3-磷酸甘油酸酯抑制果糖-双磷酸醛缩酶，并且在机制上不同的I类果糖-双磷酸醛缩酶I类中观察到了PEP的活化作用。总体而言，可以验证八种新观察到的酶-代谢物相互作用中的五种的调节功能。
图5 体外酶分析
讨论
为了深入探究蛋白质-代谢物相互作用，系统地将蛋白质-（极性）代谢物相互作用映射到了可以说是特征最充分的分子网络中：大肠杆菌中央代谢。为此，研究人员开发了更高通量的配体检测NMR检测方法，最近被证明可在弱相互作用的高灵敏度下直接读出结合事件的情况。29种中心酶与55种代谢物的代谢物结合谱鉴定出76种新的相互作用。检测到的相互作用分布在大多数酶上，而不是集中在少数调节中心上。尽管NMR分析没有提供直接的功能证据，但基于从蛋白质-代谢物相互作用数据库和功能性体外分析中回收阳性对照，估计新检测到的结合事件中有60％以上是有功能的。通过在定义的生物学子网络中构建蛋白质-（极性）代谢物相互作用的第一个近乎全面的图谱，可以将已知相互作用的数量实质上增加一倍。鉴于已经对中枢代谢进行了大量研究，结果表明，有关蛋白质-代谢物相互作用的当前可用信息可能只是冰山一角。
最引人注目的是与嘌呤核苷酸的大量相互作用，最主要的是与GTP的相互作用。尽管已知ATP在几种生物体中与多种蛋白质结合，但GTP的混杂结合只是最近才报道。嘌呤核苷酸的频繁结合似乎不能用特异性蛋白质与RNA结合的倾向来解释，因为研究人员发现与最近发表的两项大肠杆菌研究的RNA结合酶没有关联。嘌呤核苷酸作为生物水溶助长剂的最新发现可以提供一个解释；但是，仅在比测定中使用的浓度高得多的浓度（> 5 mM相比于0.2 mM）中观察到对蛋白质聚集的影响。通常，嘌呤核苷酸结合可能诱导酶活性与能量辅助因子的结合，尽管这不能解释GTP优于ATP的重要性。或者，与嘧啶相互作用相比，大量的嘌呤可能只是反映了人们对基于嘌呤的调节剂的普遍偏爱，正如第二信使（如cAMP和cGMP）所看到的那样。与核苷酸相反，氨基酸与很少的中心酶相互作用。因此，中央代谢似乎主要通过中央代谢物和辅因子来调节。通常，在糖酵解和戊糖磷酸途径中，调节相互作用更为频繁，而TCA循环酶的相互作用要少得多。该观察结果与先前有关TCA周期主要是转录调控且代谢产物调控相对较少的报道相一致。值得注意的是，两种测试的苹果酸酶（MaeA和MaeB）催化TCA循环中间苹果酸脱羧为丙酮酸，表现出许多新的代谢物相互作用。如前所述，这可能反映了对从TCA周期分支出来的反应进行严格调节的需要。
通过代谢物结合来调节酶活性可以通过竞争性或变构相互作用来实现，即分别在蛋白质的活性位点或其他地方结合。大约60％的检测到的结合剂与其蛋白质靶标的天然反应物具有高度化学相似性（> 0.5），表明在活性位点存在竞争性结合。该结论与以下观点一致：大多数已知的代谢物调节剂在化学上均与其酶靶标的底物或产物相似。因此，剩余的40种具有低化学相似性评分（≤0.5）的相互作用被怀疑在距活性位点一定距离处变构结合。使用体外酶分析，确认了八种测试相互作用中的五种的调节作用，特别是表明分支点酶Zwf被频繁相互作用的代谢产物ATP和GTP抑制。总之，在对酶活性有显着影响的五种相互作用中，两种代谢物在其生理浓度范围内（Zwf-GTP和FbaA-ATP）显示出这种作用，另外三种在浓度比预期的生理稳定剂高出七倍时显示出这种作用。状态代谢物的浓度范围（Zwf–ATP，FbaA–3PG和FbaA–PEP；2017；附录图S10）。
先前发表的配体检测NMR实验确定了烯醇酶和6-磷酸果糖激酶I的15种相互作用，在此仅报告了四个，在两个数据集中均检测到其中两个（Eno–PEP和PfkA–AMP）。当前数据集中检测到的相互作用数较少，可能是由于以下因素的组合：（i）一种新的具有生理盐浓度的测定缓冲液，以最大程度地减少非特异性结合；（ii）更严格的分析，包括全自动峰选择和排除随时间推移而不稳定的代谢产物信号。实验包括27种蛋白质和18种代谢物，这些蛋白质在最近的蛋白质组学研究中也涉及到，该研究基于有限的蛋白水解与质谱联用。两项研究之间的重叠是11种相互作用，其中6种以前没有报道过，与其他大规模研究可以预期的相似。此外，LiP-MS和NMR分析分别在同一组蛋白质和代谢物上产生了56和37个不重叠的相互作用。这些差异可能是由于NMR报告了在体外条件下的直接相互作用而引起的，而LiP-MS则在天然细胞提取条件下感觉到了直接和间接的作用。此外，尽管T1rho NMR对与1M解离常数的相互作用最敏感，但LiP-MS的灵敏度范围更广。尽管存在许多不重叠的相互作用，但对于相同代谢物检测到的相互作用数量却是可比较的。值得注意的是，在NMR实验中，真假阳性率是LiP-MS的两倍（30％对15.6％），假阳性率相仿（5％对5.5％）。因此，配体检测NMR方法是对最近基于质谱的蛋白质组学方法的补充，该方法在特定代谢物和蛋白质类别方面也没有偏见。体外NMR分析不易受到间接影响，也可用于低丰度蛋白和蛋白水解模式不利的蛋白，允许更高的通量代谢物代谢，并可能应用于与代谢物相互作用的RNA靶标。另一方面，MS蛋白质组学允许在天然细胞提取物中工作，并在测试的蛋白质数量上提供更高的通量，并且在蛋白质水解受限的情况下，还可以提供有关潜在的变构结合位点的信息。
结论
由于调节蛋白与代谢物之间相互作用的能量很弱，而且大多数现有方法只能提供间接检测，因此仍然需要对调节蛋白与代谢物之间的相互作用进行系统定位。 在先前开发的配体检测NMR方法的首次大规模应用中，研究人员证明了在蛋白质和代谢物的预选空间中详尽绘制相互作用的潜力，提供了结合事件的直接读数 对弱相互作用的敏感性，而不受特定蛋白质或代谢物类别的限制。利用此处建立的全自动数据分析管道，包括NMR光谱转换，峰检测和相互作用定量，配体检测到的NMR可以成为发现不同生物网络（包括转录因子）中功能性蛋白质-代谢物相互作用的宝贵工具。
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