编译：微科盟花城，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
以肠-脑轴为靶点的益生菌疗法已被证明是治疗自闭症患者的有效方法。本研究旨在评估三种乳酸菌菌株（瑞士乳杆菌CCFM1076、嗜酸乳杆菌La28和嗜酸乳杆菌JCM 1132）缓解VPA诱导的大鼠从断奶到性成熟的自闭症行为症状的能力。基于VPA诱导的自闭症模型，本文首次评估了5-羟色胺（5-HT）的合成以及外周和中枢神经系统（PNS和CNS）中5-HT系统的代谢能力。在第8周结束时，本文还评估了肠道微生物群和短链脂肪酸（SCFA）。在改善自闭症行为症状的同时，本文发现瑞士乳杆菌CCFM1076在调节5-HT合成代谢和分解代谢、平衡PNS和CNS的兴奋性和抑制性神经递质释放以及增加下丘脑催产素（OT）合成方面更为有利。5-HT水平与GABA、谷氨酸（Glu）和OT的释放显著相关，提示5-HT在神经内分泌网络中起着重要作用。对肠道微生物群和SCFA水平的分析显示，VPA处理的大鼠中的Turicibacter丰度更高，丁酸水平更低，据报道与5-HT水平相关。瑞士乳杆菌CCFM1076有助于降低Turicibacter丰度并上调丁酸水平，而嗜酸乳杆菌La28和嗜酸乳杆菌JCM1132则没有。瑞士乳杆菌CCFM1076可通过改善PNS和CNS中5-HT系统的平衡来恢复神经递质的稳态，从而改善自闭症行为。这一发现将有助于开发治疗自闭症的生物制品，并有助于建立一种模仿自闭症患者肠道环境的治疗模式。
原名：Daily intake of Lactobacillus alleviates autistic-like behaviors by ameliorating the 5-hydroxytryptamine metabolic disorder in VPA-treated rats during weaning and sexual maturation
译名：每日摄入乳酸杆菌可改善VPA诱导的大鼠断奶和性成熟期间的5-羟色胺代谢紊乱，减轻自闭症行为
期刊：Food & Function
IF：4.171
发表时间：2021.2.18
通讯作者：王刚
通讯作者单位：江南大学食品科学与技术国家重点实验室
怀孕期间暴露于600 mg/kg VPA的所有大鼠的胚胎均显示尾部异常（图1A）。这些大鼠的尾巴通常是弯曲的，比健康大鼠的尾巴短，表明VPA暴露发生在子宫内。对健康组和自闭症组进行了OPLS-DA分析（图1C和1D），结果表明，两组之间的差异非常显著。排列检验表明，模型中没有过度拟合现象，反映了真实的样本情况，模型是成功的。因此，该模型真实地反映了真实样本(R2=0.425,Q2 = −1.07)，表明VPA成功诱导了大鼠模型。
图1 胚胎发育和行为。（A）大鼠尾畸形的倒置荧光显微镜观察。（B）自闭症和健康大鼠行为的OPLS-DA分析。（C）OPLS-DA模型验证。（D）行为分析。（E）行为的PCA分析。VPA处理的大鼠表现出明显的行为异常。这三种乳酸菌有助于改善自闭症患者的行为（图1B）。本文基于行为指标数据进行PCA分析，以确定三种乳酸菌菌株治疗对自闭症样行为的影响，如图1E所示。VPA处理组大鼠除社交障碍和重复刻板行为外，认知和探索行为显著降低，表现出绝望和焦虑情绪。利培酮能显著改善自闭症患者的行为和焦虑抑郁情绪。瑞士乳杆菌CCFM1076显著改善VPA处理大鼠的社会交往、认知能力和重复刻板行为和对VPA治疗大鼠的自主探索和焦虑无明显影响。3、乳酸杆菌通过促进色氨酸合成和代谢调节5-HT系统功能障碍VPA处理的大鼠出现5-HT系统异常。结肠、粪便、血清（图2A、B和C）、谷草转氨酶（Cere）和PFC中5-HT及其前体（L-trp和5-HTP）及其最终代谢物（5-HIAA）的水平显著下调，表明5-HT合成代谢和分解代谢的显著功能障碍，这在自闭症中一直被证明是异常的（图2D和E）。此外，与健康大鼠相比，VPA处理的大鼠结肠、粪便、血清、小脑和PFC中的L-trp水平下调。利培酮是DA和5-HT的拮抗剂，有助于5-HT系统的正常化；调节两个大脑区域的5-HT代谢途径；改善结肠、粪便和血清中的5-HT系统，特别是血清5-HT水平。然而，对结肠、粪便和血清中5-HTP或L-trp水平的代谢调节没有显著影响。因此，利培酮对Cere和PFC中5-HT系统的调节可能不依赖于结肠、粪便和血清中的底物。瑞士乳杆菌CCFM1076显著上调结肠、粪便、血清和大脑区域的5-HT水平；上调5-HT前体、L-trp和5-HTP水平；促进5-HT代谢终产物5-HIAA的合成。因此，瑞士乳杆菌CCFM1076对颅内5-HT系统的调节作用可能依赖于结肠、粪便和血清中的L-trp和5-HTP。嗜酸菌La28显著调节5-HT（结肠、粪便和血清）的合成代谢，但在中枢神经系统中5-HT的调节能力较差，这也表明结肠、粪便和血清中L-trp和5-HTP水平的正常化不是导致中枢神经系统5-HT系统正常化的主要机制。嗜酸乳杆菌JCM 1132对5-HT系统的调节能力较差。总之，这三种乳酸菌菌株增加了结肠和粪便中L-trp的合成和代谢，而瑞士乳杆菌CCFM1076有助于调节结肠、粪便、血清、小脑和PFC中的5-HT水平。
图2 外周系统和中枢神经系统中5-HT及其前体和最终代谢物的水平。（A）结肠中的L-trp、5-HTP、5-HT和5-HIAA水平。（B）所有组的血清L-trp、5-HTP、5-HT和5-HIAA水平。（C）粪便中L-trp、5-HTP和5-HIAA水平。（D）小脑中的L-trp、5-HTP、5-HT和5-HIAA水平。（E）前额叶皮质的L-trp、5-HTP、5-HT和5-HIAA水平。4、瑞士乳杆菌CCFM1076显著平衡VPA治疗大鼠的血清兴奋性和抑制性神经递质水平VPA处理的大鼠血清中抑制性和兴奋性神经递质的分泌异常（图3A）。GABA、Ach和DA水平显著下调，Glu水平显著上调。嗜酸乳杆菌La28显著降低Glu水平。嗜酸乳杆菌JCM 1132对血清抑制性和兴奋性神经递质水平的调节能力较差。
图3 神经递质分析。（A）血清GABA、Glu、Ach、DA水平及Glu/GABA比值。（B）小脑GABA、Glu、Ach、DA水平及Glu/GABA比值。（C）mPFC GABA、Glu、Ach和DA水平及Glu/GABA比值。5、乳酸菌平衡VPA处理大鼠前额叶内侧皮质和小脑抑制性和兴奋性神经递质的分泌VPA处理的大鼠PFC（图3B）和Cere（图3C）中的神经递质水平显著异常。VPA处理组大鼠脑内Glu/GABA和Ach显著升高，DA有明显下调趋势，提示兴奋性和抑制性递质水平明显失衡。利培酮可能参与调节兴奋性和抑制性递质释放的平衡，具有明显的调节作用。瑞士乳杆菌CCFM1076对平衡Glu和GABA的释放有显著作用。嗜酸乳杆菌JCM 1132也平衡了谷氨酸和γ-氨基丁酸的释放，嗜酸乳杆菌La28增加了乙酰胆碱的水平。因此，瑞士乳杆菌CCFM1076可能通过平衡VPA处理大鼠PFC和Cere中抑制性和兴奋性神经递质的分泌来缓解神经递质分泌障碍。6、瑞士乳杆菌CCFM1076增强VPA治疗大鼠下丘脑催产素（OT）合成VPA处理组大鼠下丘脑OT合成明显减少。利培酮和瑞士乳杆菌CCFM1076显著增加VPA处理大鼠下丘脑OT合成，而嗜酸乳杆菌La28和JCM 1132则无显著影响。7、与5-HT减少相关的Turicibacter丰度被瑞士乳杆菌CCFM1076显著降低VPA处理的大鼠和健康大鼠之间的肠道微生物多样性没有显著差异，但是VPA处理的大鼠的微生物多样性在三种乳酸菌菌株干预后显著增加（图4A-D）。基于未加权UniFrac距离的PCoA分析不能完全区分VPA治疗组、利培酮组和健康组之间的影响，因为样本存在部分重叠（图4E）。此外，基于Bray-CCurtis距离的CPCoA分析表明，五组之间存在显著差异，方差为30.7%，p>0.001（图4F）。因此，VPA处理的大鼠肠道菌群的组成与健康大鼠明显不同，三株乳酸菌能显著调节肠道菌群。
图4 α-多样性和多样性分析。（A-D）使用Chao1、observed、ACE和Shannon指数评估多样性。（E）使用PCoA和CPCoA评估多样性。在科水平上，瑞士乳杆菌CCFM1076显著降低Clostridiaceae 1，Deferribacteraceae，Peptostreptococcaceae，Marinifilaceae和Erysipelotrichaceae的相对丰度，并上调VPA处理大鼠的Tannerellaceae水平（图5A）。嗜酸乳杆菌JCM 1132显著降低了Helicobacteraceae，Marinifilaceae和Deferribacteraceae的含量。在门水平（图5D），VPA处理的大鼠的厚壁菌与拟杆菌的比率增加，乳酸杆菌显著改变了这一比率。在属水平上（图5B和C），瑞士乳杆菌CCFM1076显著增加了Christensenellaceae R-7 group，Ruminococcus1，Eubacterium coprostanoligenes strains，Negativibacillus，Ruminococci UCG-009和Ruminococcus 2的水平，并显著降低了Turicibacter的水平，据报道与5-HT水平下降有关。然而，嗜酸乳杆菌La28和JCM 1132未能显著调节这些细菌的丰度。
图5 肠道菌群分析。（A）肠道微生物群在门和科水平上操作分类单位的气泡图。（B）不同肠道菌群的属水平分析。（C）VPA基因与健康组有显著差异。（D）厚壁菌/拟杆菌比率。（E）SCFA水平分析。VPA处理的大鼠在盲肠内容物中显示SCFA代谢异常（图5E和F）。与健康大鼠相比，VPA治疗组大鼠的丁酸水平显著降低，丙酸水平显著升高。瑞士乳杆菌CCFM1076显著提高丁酸水平，嗜酸乳杆菌La28的丁酸水平无显著升高趋势。此外，嗜酸乳杆菌La28显著降低丙酸和乙酸的含量。基于上述指标的分析，瑞士乳杆菌CCFM1077能够缓解VPA治疗大鼠的自闭症行为及其相关生理指标。然后对所有这些指标进行相关性分析（图6）。发现VPA处理的大鼠的探索行为、社会交往、认知能力和重复刻板行为与外周系统（血清和结肠）和中枢神经系统（Cere和PFC）的兴奋性抑制性神经递质水平显著相关。外周系统（血清和结肠）和中枢神经系统（Cere和PFC）5-HT水平与OT和GABA水平呈正相关，与Glu水平呈负相关。不同区域的神经递质也存在着内在联系。血清5-HT水平与脑组织5-HT水平呈显著正相关。PFC与Cere之间5-HT水平呈显著正相关。这两个脑区在GABA和Glu水平上也有显著的正相关。下丘脑OT水平与脑、PFC中5-HT、GABA水平呈显著正相关。此外，PNS（血清和结肠）和CNS（Cere和PFC）中5-HT水平与丁酸水平呈显著正相关，与Turicibacter丰度呈负相关。Turicibacter丰度和丁酸水平也与中枢神经系统中的GABA、Glu和OT水平显著相关。同时，丁酸水平与Turicibacter丰度呈负相关。因此，Turicibacter和丁酸盐可能在孤独症患者的神经递质系统功能障碍中起重要作用，并可能主要通过干扰5-HT系统而持续破坏神经递质系统的稳态。因此，本文提出神经内分泌失调的一个重要原因，自闭症患者的系统异常是肠道内稳态的破坏，导致5-HT系统功能失调，并继续影响与5HT密切相关的神经递质的产生。
图6 相关分析热图。热图显示VPA处理大鼠行为、OTU丰度、行为、神经内分泌物质和SCFAs之间存在Spearman相关系数。颜色代表相关性，红色表示正相关性，蓝色表示负相关性。显著性为*（p<0.05）和**（p<0.01）。OFT:野外试验；ST:社会性试验；NTO:新物体识别试验；MBT:大理石掩埋试验；FST:强迫游泳试验；FPN:粪便颗粒数；BA:丁酸；PA:丙酸；F/B:厚壁菌/拟杆菌。在本研究中，VPA处理的大鼠在妊娠12.5天暴露于VPA。自闭症雄性大鼠的观察行为与自闭症患者的临床表现相似。此外，它们表现出焦虑和抑郁的症状，并伴有尾巴畸形和部分手畸形，这与以前的报道一致。研究发现三种乳酸菌的干预通过影响外周和中枢神经系统5-HT代谢来调节神经递质水平，从而减轻VPAT治疗大鼠的自闭症行为、焦虑和抑郁。此外，基于肠道微生物群和SCFA水平的评估，对Turicibacter丰度和丁酸水平的影响可能是瑞士乳杆菌CCFM1076帮助VPAT治疗大鼠5-HT系统和相关神经递质水平正常化，从而减轻自闭症行为的主要原因。5-HT系统功能障碍是与ASD相关的一致发现。1961年，6%的自闭症患者被发现患有高性激素血症，这是一种以血小板中5-羟色胺含量高为特征的状态，可能是由于通过5-羟色胺转运体（SERT）增加5-羟色胺摄取。此外，血液中游离血清素水平低与ASD症状的严重程度增加有关，而自闭症患者大脑中5-HT合成水平降低了约25%。这与本研究中观察到的显著下调的血清5-HT水平一致。此外，肠道5HT的合成和代谢也明显异常。5-HTP和L-trp可作为中枢神经系统合成5-HT的前体，跨越血脑屏障。这种能力与中枢神经系统5-HT的合成密切相关。与健康大鼠相比，VPA处理组大鼠结肠、粪便、血清和脑区L-trp和5-HTP水平均下调，提示VPA处理组大鼠可能存在L-trp合成和代谢异常。内皮细胞中的色氨酸羟化酶1（TPH1）将L-trp转化为5-HTP，然后转化为5-HT。L-trp和5-HTP在跨越血脑屏障后，通过TPH2在脑内的作用最终转化为5-HT。然后，5-HT被SERT转运以执行其生理功能，并最终被单胺氧化酶（MAO）降解为5-HIAA并由肾脏排出。本文发现VPA处理的大鼠肠道和CNS中L-trp、5-HTP、5-HT和5-HIAA的水平均下调。这些结果表明，肠内L-trp合成减少，TPH1、TPH2、SERT和MAO活性也可能异常。此外，利培酮靶向具有不同免疫原性的多受体系统，对5-羟色胺5HT2A的免疫原性高于DA D2受体。这可能是本研究的原因尽管利培酮增加了Cere和PFC中5-HT的水平，但L-trp和5-HTP的水平没有显著增加。与利培酮类似，嗜酸乳杆菌La28可能通过调节某些与5-HT相关的受体来提高小脑中5-HT的水平。因此，VPA治疗的大鼠在结肠、粪便、血清、小脑和PFC中存在显著的5-HT合成代谢紊乱，表明5-HT是一种生物标记物，至少是VPA诱导的自闭症。先前的研究表明，益生菌可以通过减少炎症因子、恢复肠道屏障完整性、调节色氨酸代谢和调节5-HT水平来调节情绪。此外，SCFAs可促进内皮细胞TPH1的表达和5-HT的释放。在这项研究中，瑞士乳杆菌CCFM1076被发现显著增加丁酸水平。瑞士乳杆菌CCFM1076对5-HT系统的调节机制可能涉及肠内丁酸的上调和TPH1表达的增加。肠道菌群分析显示，用瑞士乳杆菌CCFM1076处理的VPA处理的大鼠的Turicibacter丰度显著下调。此外，据报道，Turicibactersanguinis通过一种神经递质钠转运体样蛋白（如SERT直系同源物）在肠内捕获5-HT。氟西汀，一种5-HT再摄取抑制剂，阻止了这一过程，并抑制了这种细菌在肠道中的定植，提示Turicibacter可能参与了自闭症患者5-HT水平的失调。以往的研究也表明，T.sanguinis在小鼠肠道内可能同时参与多种途径，包括脂质和胆固醇代谢。胆固醇代谢失调是自闭症患者的常见症状。此外，据报道，Eubacterium coprostanoligenes菌株能将胆固醇分解为不可吸收的粪便甾醇，并在粪便中排出。瑞士乳杆菌CCFM1076可逆转VPA处理大鼠的显著下调状态。因此，研究了瑞士乳杆菌CCFM1076对VPA处理大鼠的生理作用可能是多方面的。然而，肠道微生物群很容易受到各种因素的影响，将在每组更多动物的基础上进行进一步的实验，为这些结果提供进一步的证据。SCFAs通过游离脂肪酸受体直接激活迷走神经纤维，并通过ECs上的单羧酸转运体穿过血脑屏障（BBB），从而向大脑发送信号。它们还可以通过抑制炎症相关通路来影响BBB的完整性，从而改变小胶质细胞的形态和功能，调节神经炎症。SCFAs还可以通过组蛋白乙酰化调节中枢神经营养因子水平，促进5-HT的生物合成。总之，SCFAs可以直接或间接地调节与神经功能、学习、记忆和情绪相关的过程。已有研究表明，丙酸通过FFAR3作用于外周系统和中枢神经系统，诱导肠内葡萄糖生成，这为SCFAs参与中枢神经系统损伤提供了直接证据。此外，腹腔注射丁酸钠（100 mg/kg每天，连续10天）可减轻自闭症小鼠的社交功能障碍，且无与运动和焦虑相关的不良影响。因此，瑞士乳杆菌CCFM1076可能显著上调肠道丁酸水平，以改善VPA治疗大鼠的社交能力。益生菌对人类神经发育障碍的胃肠道症状和特定行为症状具有潜在的治疗作用。在本研究中，三株乳酸菌对VPA诱导的类自闭症大鼠模型进行了从断奶到性成熟的干预。在三株乳杆菌中，瑞士乳杆菌CCFM1076在缓解自闭症行为及其相关生理指标方面表现出更大的优势。有助于改善自闭症行为，调节5-HT合成代谢和分解代谢，平衡外周系统和中枢神经系统兴奋性和抑制性神经递质释放，增加下丘脑OT合成。5-HT水平与PNS和CNS中GABA、Glu和OT的释放显著相关，提示5-HT在神经内分泌网络中起着重要作用。对肠道微生物群和SCFA的分析表明，尽管瑞士乳杆菌CCFM1076显著增加丁酸水平，但也显著降低了与5-HT水平降低相关的Turicibacter丰度。然而，嗜酸乳杆菌La28和JCM1132没有表现出这些作用。相关分析表明，三株乳酸菌可能通过改善肠道5-HT系统功能，恢复相关神经内分泌物质系统的稳态，从而调节VPA诱导的大鼠神经递质系统功能障碍，对VPA的发生发展具有积极影响适合自闭症患者的益生菌，进一步探索自闭症患者肠道环境的治疗模式。
