Cas9表达慢病毒载体是什么?

CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合(如野生型Cas9,Cas9n,dCas9),这取决于用户的实验目的。此外,使用单独的Cas9表达载体有利于生产稳转细胞株或者动物模型,然后使用不同的gRNA进行打靶。这种方式比起gRNA/Cas9共表达载体转导可以获得更高的打靶效率。

Cas9表达慢病毒载体可以高效地将Cas9基因通过病毒颗粒导入使用质粒方式难转染的哺乳动物细胞。Cas9慢病毒载体首先以质粒的方式构建并使用E. coli扩增,然后与多个辅助质粒一同转染至包装细胞。载体上的两个LTR区域之间的DNA序列将被转录成RNA,而辅助质粒表达的病毒蛋白进一步与这些RNA组装形成完整的病毒颗粒。有活性的病毒颗粒被释放到上清液中。病毒上清液可直接转染或者浓缩后转染细胞。当病毒感染靶细胞时,病毒RNA被反转录成DNA,然后永久性整合到宿主基因组,实现用户选择的启动子驱动下的Cas9蛋白表达。

通过改造优化,我们的慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因(这些基因由辅助质粒进行表达,用于病毒包装过程),使其产生的慢病毒颗粒是复制缺陷型的(即病毒只能用以转导细胞但是不能自我复制),具有很高的生物安全性。

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