科研 | 转录组学应用：MdMYB8通过激活海棠果实中MdFLS启动子参与黄酮醇生物合成（国人佳作）
编译：Jerry，编辑：十九、江舜尧。
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黄酮类化合物是多酚类物质，在植物抗逆性和生长发育中起着重要作用。它们也是人类饮食的重要组成部分。海棠栽培品种“Flame”因其果皮中黄酮醇含量高，为研究黄酮醇的生物合成提供了一个很好的模型。为了更详细地了解与果实发育有关的黄酮醇调节网络，研究者对不同发育阶段的海棠果实样本进行转录组测序。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定了一个黄酮醇生物合成相关基因模块，GO和KEGG分析表明，植物激素参与了果实发育过程中黄酮醇的生物合成调控。通过核心基因相关网络分析和酵母单杂交分析，筛选出一个候选的的转录因子MdMYB8进行进一步研究。MdMYB8在转基因“orin”苹果愈伤组织的稳定过表达或RNAi基因敲除分别上调或下调了黄酮醇含量，表明MdMYB8是黄酮醇生物合成的调节因子。本研究为黄酮醇的合成和调控提供了有价值的参考资料。
论文ID
原名：MdMYB8 is associated with flavonol biosynthesis via the activation of the MdFLS promoter in the fruits of Malus crabapple
译名：MdMYB8通过激活海棠果实中MdFLS启动子与黄酮醇生物合成有关
期刊：Horticulture Research
IF：3.64（1区）
发表时间：2020.02
通讯作者：Ji Tian 和 Yuncong Yao
通讯作者单位：北京农业大学北京市分子育种先进技术创新中心和植物科学与技术系
DOI号：10.1038/s41438-020-0238-z
实验设计
本文首先以海棠果实的5个不同发育阶段（花朵全盛开后35、60、95、120和150天）的果皮作为材料进行转录组测序，鉴定其中的差异表达基因；并采用高效液相色谱法测定其中的黄酮类成分含量，然后通过WGCNA鉴定出与黄酮生物合成相关的核心转录因子，最后通过酵母单杂、过表达以及RNAi验证候选转录因子的功能。
结果
1 果实发育阶段的转录组分析
常绿果树栽培品种“Flame”因其果皮中黄酮醇含量高，为研究黄酮醇生物合成提供了一个很好的模型。为了更详细地了解海棠果实发育过程中黄酮醇的调节网络，以海棠果实的5个不同发育阶段（花朵全盛开后35、60、95、120和150天）的果皮作为材料进行转录组测序（图1a）。
每个阶段有3个生物学重复，总共15个样品。Clean reads 的长度从11,130,344到13,182,947不等。在82.96%到88.64%的测序结果可以比对到苹果基因组。所有15个cDNA文库的Q30均大于90%（表1）。随后，FPKM值小于0.5的序列被移除，最后总共有26,399、25,492、42,133、40,160和24,490个转录本分别在阶段1-5中有表达。大约51%的基因FPKM值在0.5-5之间，46%在5-100之间（图1b）。主成分分析和皮尔逊相关分析表明，每个发育阶段的三个生物重复之间存在高度相关性（r2=0.858-0.986）（图1c）。五个阶段共有的转录本为18635个（图1d）。
表1 RNA测序数据及质量控制
图1海棠“Flame”果实发育过程中RNA-seq数据表达谱的研究。“Flame”果实在五个典型发育阶段的果实表型。b五个果实发育阶段的转录本数目。c RNA序列数据的主成分分析。d五个果实发育阶段RNA序列数据的韦恩图
2 不同发育阶段差异表达基因的比较
为了鉴定果实发育过程中的差异表达基因（DEGs），研究者对5个发育阶段进行了比较。在每组比较中，根据表达水平| log2（FC）|>1和FDR<0.05筛选DEGs，并对DEGs进行GO和KEGG富集分析，结果表明，DEGs显著富集在：“植物激素信号转导”、“苯丙酸生物合成”、“苯丙氨酸代谢”，“糖酵解/糖异生”、“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”、“果糖和甘露糖代谢”、“类黄酮生物合成”和“淀粉和蔗糖代谢”等代谢通路（图2）。值得注意的是，这些生物过程都与黄酮类化合物的生物合成密切相关。
图2从果实发育过程中发育阶段的两两比较中鉴定的DEGs的KEGG富集分析。a-d：阶段1 vs阶段2（a），阶段2 vs阶段3（b），阶段3 vs阶段4（c），阶段4 vs阶段5（d）。Q值是多重假设检验修正的P值。q值的范围为[0-1]。这个数字越接近0，富集作用就越显著。富集因子表示差异表达基因中注释到该通路的基因比例与该物种基因注释到某通路的基因比例的比值。富集因子越大，富集程度越高。
3 黄酮醇生物合成相关WGCNA模块的鉴定
采用高效液相色谱法对5个发育阶段（开花后35、60、95、120、150d）的果皮进行了黄酮类成分分析。槲皮素-7-O-葡萄糖苷是黄酮类化合物的主要成分，其丰度在发育过程中逐渐增加，3期迅速增加，5期达到高峰（图3a）。相比之下，原花青素B2、根皮苷和萹蓄苷的含量降低，表儿茶素和原花青素B1的含量随着发育而增加，而花青素仅在第5阶段检测到（图3a）。
观察到，随着果实发育，FLS（MD08G1121600）的表达增加，而原花青素（PA）生物合成基因LAR（无色花青素还原酶）（MD16G1048500）和ANR（花青素还原酶）（MD05G1335600、MD06G1103800、MD06G1103900和MD10G11311100）的表达量降低，LAR（MD13G1046900）和ANR（MD01G1077800，MD01G1077900）增加。而与花青素生物合成有关的PAL（MD01G1106900、MD04G1096200、MD07G1172700、MD12G1116700）、CHS（MD04G1003300、MD13G1285100）、CHI（MD01G1117800、MD01G1118100、MD01G1118300、MD01G1167300、MD07G1186300、MD07G1233400）、DFR（MD03G1214100、MD08G1103100、MD11G1229100和MD15G1024100）、ANS（MD03G1001100、MD06G1071600和MD07G1222600）和UFGT（MD07G1007400、MD09G1141200和MD09G1141700）的表达水平没有改变。而F3H（MD02G1132200、MD15G1353800）和F3'H（MD14G1210700）基因表达量则有所下降（图3b）。总体来说，化合物丰度与相关生物合成基因的表达水平之间存在相关性（图3a）。
加权基因共表达网络分析（WGCNA）是一种识别与某些功能或序列相关的候选核心基因的方法。用WGCNA鉴定了果实发育过程中调节类黄酮代谢的转录因子（TFs）。通过分析，8681 DEGs被分成12个不同的模块，这些模块用不同的颜色标记（图3c）。其中深石板蓝模块（MEdarkslateblue，1662个基因）与黄酮醇（quercetin-7-O-glucoside）积累的相关性最高，相关系数为0.8。
图3 WGCNA鉴定了不同黄酮类化合物相对应的DEGs。a五个“Flame”果实发育期黄酮类化合物的高效液相色谱分析。b应用RNA-seq技术分析5个果实发育阶段类黄酮途径基因的表达。c层次聚类分析以及黄酮类化合物和模块的相关性分析。黄酮醇生物合成与基因表达量相关性最高的模块名称下面以红色下划线表示。
4 MEdarkslateblue模块基因的KEGG分析
KEGG数据库用于确定与MEdarkslateblue模块相关的主要代谢途径（图4a）。聚类分析结果的热图表明，表达量上调的基因在MEdarkslateblue模块中明显富集。与淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、植物激素信号转导、苯丙氨酸代谢、苯丙酸生物合成和类黄酮生物合成途径相关的基因显著富集于上调的基因模块（图4b，c）。
通过对“激素信号转导”相关的DEG进一步分析发现，生长素应答和促生长蛋白显著富集，并且在果实发育过程中表现出持续增加的表达（图4d）。相比之下，乙烯和ABA信号转导或应答蛋白以更具阶段特异性的方式上调（图4d）。
图4 MEdarkslateblue模块中DEGs的功能分类与比较。A MEdarkslateblue模块中DEGs的KEGG富集分析。b显著富集的MEdarkslateblue模块特异基因的聚类热图。c上调基因模块中类黄酮生物合成相关DEGs的热图比较。与MEdarkslateblue模块中植物激素信号转导相关的DEG分类
5 类黄酮生物合成相关核心基因的鉴定
在表达网络中高度连接的节点被定义为核心（hub）基因，它通常与生物过程和相互作用有关。在MEdarkslateblue模块中识别的许多DEGs被注释为转录因子（TFs），包括几个MYB、ERF、bHLH和WRKY TFs。它们的相对表达水平如图5a所示。根据hub基因相关网络和它们的表达模式，选择其中11个核心TFs进行进一步分析，11个候选Hub TFs包括乙烯应答转录因子2（MD01G1177000）、同源框亮氨酸拉链蛋白HOX6（md01g226600）、WRKY转录因子6（MD05G1349800），MYB转录因子8（MD06G1217200）、WRKY转录因子75（MD13G1122100）、乙烯应答转录因子ERF115（MD13G1130700）、乙烯应答转录因子1B（MD13G1213100）、乙烯应答转录因子CRF2（MD14G1120000）、40S核糖体蛋白S7（MD14G1227500）、WRKY转录因子7（MD15G1078200）和bHLH135转录因子（MD17G1049300）（图5b，c）。qRT-PCR和RNA-seq数据的相关性支持候选hub基因选择的可靠性（图5d）。
作者使用酵母单杂分析了11个TF基因编码的11个蛋白与FLS启动子的相互作用。其中只有MD06G1217200（MYB8）与MdFLS启动子之间有相互作用，其他候选基因均没观察到相互作用（图5e）。
图5 MEdarkslateblue模块中与类黄酮生物合成相关的hub基因的鉴定和选择。a MEdarkslateblue模块中差异表达的转录因子的热图比较和分类。b对MEdarkslateblue模块中108个TFs的网络分析。c来自MEdarkslateblue模块的前11个枢纽基因和相关基因的网络分析。d RNA-seq和qRT-PCR获得的基因表达数据的散点图。 e酵母单杂交分析筛选的TFs与黄酮醇生物合成基因FLS或花青素生物合成基因UFGT的相互作用
6 MdMYB8在类黄酮生物合成途径中作用的功能分析
为了进一步评估MdMYB8（MD06G1217200）在类黄酮生物合成中的作用，研究者在苹果愈伤组织中对MdMYB8进行过表达（pBI101-MdMYB8）和RNAi（pBI101-RNAi-MdMYB8）基因沉默。pBI101MdMYB8或pBI101-RNAi-MdMYB8转化的愈伤组织与对照愈伤组织相比，颜色无明显差异。用二苯基硼酸-2氨基乙基酯（DPBA）染色法原位观察转基因愈伤组织中黄酮醇的积累规律。光照1周后，MdMYB8高表达愈伤组织呈现强烈的橙色荧光，表明槲皮素大量积累，MdMYB8RNAi愈伤组织的荧光强度弱于对照（图6a）。
高效液相色谱分析还表明，在MdMYB8过表达的愈伤组织中，黄酮醇（槲皮素-7-O-葡萄糖苷）和原花青素B1的积累量显著增加，而原花青素B2、表儿茶素、萹蓄苷和根皮苷的含量显著降低（图6b）。在MdMYB8 RNAi愈伤组织中观察到相反的结果。qRTPCR结果表明，与对照组相比，在MdMYB8过表达或MdMYB8 RNAi愈伤组织中，黄酮醇生物合成相关的MdF3′H和MdFLS基因以及花青色合成相关的MdLAR1、MdLAR2、MdANR1和MdANR2基因的表达水平分别显著升高或降低（图6c）。与对照组相比，花青素相关的MdPAL、MdCHI、MdF3H、MdANS和MdUFGT基因的表达没有显著变化（图6c,d）。
图6 苹果愈伤组织中MdMYB8（MD06G1217200）的过表达或RNAi基因敲除。。a在日光和紫外光下观察对照（pBI101）、MdMYB8过表达（pBI101-MdMYB8）和MdMYB8敲除（pBI101-RNAi-MdMYB8）苹果愈伤组织。用黄酮醇特异性染料DPBA对愈伤组织进行染色。B过表达苹果愈伤组织和RNAi苹果愈伤组织中黄酮类化合物的含量。c、d MdMYB8（MD06G1217200）过表达的表达苹果愈伤组织和RNAi苹果愈伤组织黄酮合成基因的qRT-PCR分析。对3个生物学重复样品进行qRT-PCR和HPLC分析。误差条表示三次重复测量的平均值±SE的标准误差。条形图上方的不同字母表示显著不同的值（P<0.05），采用单因素方差分析（ANOVA）进行计算，然后进行Tukey多范围检验。
结论
总而言之，实验结果表明，MdMYB8调节海棠果实黄酮醇生物合成，生长素，乙烯，ABA，和JA也可以参与这一过程。这些研究为进一步了解海棠果实发育过程中的黄酮醇调控网络提供了更为详细的信息，也为研究花青素缺乏的植物中黄酮醇的生物合成提供了新的见解。
评论
海棠是一种具有重要经济价值的观赏植物，其果皮中含有大量的黄酮醇，研究表明黄酮醇在不同果实类型和种类中调节是多样性的，而海棠的黄酮醇调控网络至今未知。这项研究有助于研究者进一步了解海棠果实发育过程中的黄酮醇调控网络，为今后以黄酮醇含量高的形式选育营养价值高的海棠提供理论依据。加权基因共表达网络分析 (WGCNA, Weighted correlation network analysis)是用来描述不同样品之间基因关联模式的系统生物学方法，可以用来鉴定高度协同变化的基因集, 并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定候补生物标记基因或治疗靶点，是目前非常火热的一项研究内容，本研究也通过WGCNA成功找到了与黄酮醇调控相关的转录因子，进一步验证WGCNA分析的可靠性，值得关注。
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