编译：西土城外杠杆精，编辑：十九、江舜尧。
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导读
心衰是一种以心脏结构功能受损为表现的慢性病，是公认的全球性的流行病且患病率在逐年增长。过去，心衰的诊断主要基于超声心动图，包括左心室扩张和心脏功能障碍（左心室射血分数<40%）。研究显示导致心衰的生物过程中会导致基因表型改变。因此，研究转录组及相关改变有助于科研人员发现相关分子机制，有助于更早、更准确的诊断心衰和评估预后。
原名：Multi-level transcriptome sequencingidentifies COL1A1 as a candidate marker in human heart failure progression
译名：多级转录组测序确定COL1A1为人类心力衰竭进展的候选生物标志物
期刊：BMC Medicine
IF：8.285
发表时间：2020年
通讯作者：宋江平&赵中明
通讯作者单位：中国医学科学院阜外医院心血管外科&德克萨斯大学休斯顿健康科学中心医学生物信息学院
DOI号：10.1186/s12916-019-1469-4
本文首先对30例的左心室样本进行多组学分析，确定COL1A1做为潜在Biomarker，随后使用另一队列中139名患者的血清样本进行验证，寻找及确定潜在Biomarker流程如下图1，验证实验流程如下图2。
图1 寻找及确定潜在Biomarker的实验流程
图2 验证实验流程图
1 差异RNA筛选
21例心衰（HF）病人与9例脑死亡器官捐献者的转录组RNA结果比较显示， mRNAs、lncRNAs和miRNAs的主成分得分图中，两组样本均能较明显地区分开（图3 a-c），采用log2FC（log2-transformed fold change）绝对值大于1且BH法校正后P值<0.05作为差异表达RNA的筛选标准（图3 d-f），共得到126个mRNAs、16个lncRNAs和42个miRNAs。
2 差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析
采用DEGs进行功能富集分析，结果显示，几个公认的心衰相关通路出现显著富集，包括心血管疾病（cardiovascular disease，BH校正P值 = 7.13 × 10-11）、血管疾病（vascular diseases，BH校正P值 = 6.72 × 10-11）。一些纤维化相关的生物学进程富集显著，如细胞外基质（extracellularmatrix，ECM，GO：0031012，BH校正P值 = 1.55 × 10-15）以及血压调节（regulation of bloodpressure，BH校正P值 = 4.10 × 10-7）。采用Cytoscape中的ClueGO插件创建DEG GO term网络，结果显示，差异基因POSTN与5个GO分类目录（categories）下的17个term相关，作为心肌发育和心肌重构中的关键基因，研究结果中POSTN水平与心肌肉系统纤维化百分比结果一致。根据DEG GO term网络图，ACE2、KLF4、JAK2以及NR4A3等基因同样可以作为可能的生物标志物候选用于后续的研究。
为了研究差异表达lncRNAs（DElncs）和差异表达miRNAs（DEmiRs）的功能，研究者共通过126个互作关系，确定了15个DElncs的可能靶点，通过Human microRNA Disease Database（HMDD）数据库发现了21个与心衰进展相关的DEmiRs，并通过RNA富集分析和注释（RNA Enrichment Analysis and Annotation，miEAA）预测了DEmiRs对应的功能。
3 调控网络揭示心衰的新的转录组特征
构建miRNA-mRNA、lncRNA-mRNA调控网络，miRNA-mRNA调控网络（图4 a）中包含18个DEmiRs和63个DEGs，包含86个调控关系，结果显示，ECM相关terms与纤维化水平显著相关，在DEGs中显著富集。其中miR-1-3p、miR-155-5p、miR-190a-5p和miR-548ar-3p与纤维化相关基因COL1A1、COL14A1、以及COLQ显著相关。
lncRNA-mRNA调控网络图（图4 b）包含16个lncRNAs和92个DEGs，包含185个调控关系，其中LOC101926975、LOC101927179和MSTRG.16534被发现与多数DEGs相关。且lncRNA MSTRG.16534与多个ECM基因存在关联，且这些ECM基因多数同时被miR-190a-5p调控，两个网络图的结果揭示了ECM在心衰进展中发挥的作用。
图4 miRNA-mRNA与lncRNA-mRNA调控网络图
4 采用lasso回归寻找心肌纤维化基因
采用lasso回归，结果显示126个DEGs中有33个DEGs与纤维化显著相关。33个候选中，有几个是前人研究发现的心衰标志物，如NPPA (已知与心衰有关) 和FSTL3 (心脏中细胞外调节因子)。既往报道与肝纤维化相关的COL1A1（显著上调）也在发现的33个候选中。
5 确定COL1A1为心衰进展的潜在Biomarker
以心衰组21例病人首次出现心衰症状到心脏移植的时间以及心衰发作到心脏移植的时间分别统计生存时间，对33个候选Biomarker与对生存时间进行Pearson相关分析，发现了与生存时间显著相关的4个纤维化相关基因，包括：ASPN、COL1A1、COLQ和IGFBP3。随后将心衰病人分为两组（生存时间小于中位数组和生存时间大于等于中位数组）采用Kaplan-Meier生存分析，评估各个Biomarker水平与生存时间的关系。结果显示，只有COL1A1一个基因与首次出现心衰症状到心脏移植的生存时间（P = 6.1 × 10−3）以及心衰发作到心脏移植的生存时间（P = 0.04）均显著相关（显著负相关）。提示了COL1A1在心衰进展中的重要作用，但是由于样本量相对较小，该研究又设计了进一步的验证实验。
6 实验验证COL1A1作为潜在Biomarker
通过免疫组化染色（immunohistochemistrystaining assay，IHC staining assay）进一步验证，发现心衰组中COL1A1阳性区域的面积比要显著大于正常对照（图5 a、图 5 b，13.61 ± 2.55%比3.76 ± 0.64%, t检验 P = 1.1 × 10−3）。采用qRT-PCR验证一个包含20例心衰患者和9例正常对照的独立队列中COL1A1基因的表达水平，可以发现COL1A1在心衰组中显著高于正常对照组（图5 c，4.07 ± 0.48比1.13 ± 0.22，t检验 P = 4.1 × 10−4）。免疫组化实验和qRT-PCR从病理和基因转录层面验证了COL1A1基因在心衰样本中的改变。
图5 免疫组化以及qRT-PCR验证COL1A1对心衰发作1年生存率的预测作用。
a 左心室免疫组化染色结果；b 免疫组化阳性区域占比箱式图；c 左心室COL1A1基因表达的qRT-PCR结果 d 血浆中COL1A1水平对心衰生存时间的预测ROC曲线；e 采用COL1A1浓度超过256.5 ng/ml作为依据可以预测心衰生存情况。
7评估COL1A1作为诊断Biomarker的潜力和效果
为了评估COL1A1作为诊断Biomarker的潜力，收集并使用ELISA检测了139例心衰病人血浆中的COL1A1水平，创建研究队列，随访记录队列中患者心衰发作到心脏移植的生存时间，采用Pearson相关分析血浆COL1A1水平与心衰生存时间的关系，结果显示二者显著相关（相关系数 r = -0.3382， P <1.0 × 10-4）。采用血浆COL1A1作为诊断Biomarker来预测心衰生存时间，结果显示预测心衰生存时间能否超过1年的ROC曲线下面积（AUC）为0.789 (诊断cutoff值= 256.5 ng/ml, P< 1.0 ×10−4），预测心衰生存时间能否超过3年的AUC为0.656，预测心衰生存时间能否超过5年的AUC为0.624。采用血浆COL1A1浓度超过256.5 ng/ml作为心衰生存时间小于1年的预测依据，可以看到风险比例（hazard ratio，HR)为7.4（95%CI：3.5-15.8，Log-rank P < 1.0×10-4）通过转录组分析以及构建差异mRNAs、miRNAs和lncRNAs的调解网络，研究不仅高屋建瓴地提供了对心衰患者功能改变的全局视角，也找出了其中的关键调节基因。通过对心肌纤维化百分比和基因表达的回归分析以及与生存时间的相关分析，确定了可能与纤维化相关的基因。进一步采用免疫组化和qRT-PCR分析，确认了COL1A1的改变。最后使用队列对血浆中COL1A1作为诊断Biomarker的预测效果进行验证，结果显示COL1A1可以作为预测心衰进展的潜在Biomarker，尤其可以用来心衰发作1年内是否需要接受心脏移植。
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