科研 | 西班牙瓦伦西亚大学: 病毒适应度决定了植物防御反应的转录组和表观基因组重编程的强度
编译：Nicole，编辑：十九、江舜尧。
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通过识别病原体的保守基序可以触发植物抗病，越来越多的证据表明病原相关分子模式激发的免疫反应（PTI）和效应蛋白激发的免疫反应（ETI）参与了植物病毒的抗病反应。表观遗传因素影响防御基因在植物中的表达，但在病毒抗病反应中的作用以及病毒适应性等方面研究较少。为了解决这些问题，本文以拟南芥和芜菁花叶病毒TuMV为模型，比较两个不同适应性的病毒分离株引起的抗病反应，通过RNA-seq及WGBS-seq分析病毒与宿主表观遗传调控相互作用的方式。结果显示在抗病毒过程中PTI和ETI的重要作用，同时除了RNA沉默和基础免疫系统外，DNA甲基化和组蛋白修饰途径也在抗病过程中发挥调控作用，而且这种调节的有效性很大程度上取决于病毒对宿主的适应程度。
论文ID
原名: Viral Fitness Determines the Magnitude of Transcriptomic and Epigenomic Reprogramming of Defense Responses in Plants
译名: 病毒适应度决定了植物防御反应的转录组和表观基因组重编程的强度
期刊: Molecular Biology and Evolution
IF: 14.797（1区）
发表时间: 2020.4.09
通讯作者: Régis L. Corrêa、Santiago F. Elena
通讯作者单位: 西班牙瓦伦西亚大学
DOI号: 10.1093/molbev/msaa091
实验设计
研究内容
在拟南芥中不同适应性TuMV的诱导
通过10次连续传代实验在拟南芥中诱导进化了TuMV（图1A）分别称为祖传和进化分离株。不管使用哪种分离株，早期症状都在接种后约7天开始出现（图1B和1C）。然而，被进化病毒感染的植物比被祖传病毒感染的植物症状发展更快（图1C和图1D），最大的症状差异10-12 dpi（图1B和1C）。观察到的症状差异与病毒载量一致。
通过mRNA-seq，比较了祖传和进化分离株的基因组，观察到2个单核苷酸多态性（SNP），导致氨基酸取代L107F和D110N。两种取代都影响病毒蛋白VPg：VPg是一种参与病毒复制、基因组稳定、翻译和基于RNA沉默的抑制性防御的多功能蛋白。
拟南芥对感染的转录反应取决于TuMV适应程度
将拟南芥接种等量的祖传和进化分离株，并在症状出现前（5 dpi）和后期感染（12 dpi）从叶片中提取RNA。另外，对于进化的病毒在2 dpi（早期感染）取样。用mRNA-seq分析植物转录组差异，检测差异表达基因（DEG）并通过RT-qPCR验证。
与模拟接种的样品相比，在所分析的所有时间点中，对已进化病毒的反应中DEG的数量均较大。进化病毒分离株2和5 dpi的DEG数量分别比祖传分离株高3到7倍（图2A），表明进化病毒分离株引起更强的响应。随着感染的进展，分离株之间的反应趋于均衡，但12 dpi病毒的DEG总数仍高约1.5（图2A）。
对5 dpi的祖传病毒的反应的特征是与生物和非生物胁迫相关的基因富集以及代谢和生物合成过程的抑制。但是，12 dpi时与一般胁迫反应相关的核心防御相关基因只有。而进化分离株的反应要快得多：2 dpi时一般代谢和光合作用的典型基因已经发生抑制。
进化分离株对整体生理稳态具有更强的扰动作用，包括诱导与一般和生物胁迫以及转录因子有关的基因（图2B）。还观察到生物应激基因的抑制，这种变化可能对病毒侵染有利（图2B）。
使用拟南芥综合知识网络（AtCKN）对鉴定出的DEG进行网络分析表明，进化保守的WRKY转录因子可能在响应中起重要作用，包括WRKY70（一种已知的水杨酸（SA）相关防御基因的激活剂和茉莉酸（JA）相关基因的阻遏物）。5 dpi时均诱导WRKY25（SA反应的阻遏物），证明了在感染中期和晚期可能存在SA缓冲机制。其他转录因子家族在早期反应中也似乎具有相关作用。在感染的早期和晚期也观察到对其他激素的干扰，特别是与脱落酸（ABA）、乙烯（ET）和JA相关的基因（图2C）。此外，对于进化分离株而言，与PTI和ETI系统相关的几个基因均在很大程度上发生变化，其中12 dpi时PR1变化最高（图2D） 。进化分离株12 dpi有明显的PTI和PRs诱导作用，这与在该时间点SA基因的增加一致（图2C和图2D）；与ETI相关的基因似乎受到动态的调节（图2D）。通过RT-qPCR证实了与生物和非生物胁迫相关的代表性基因（PR1、WAK1、HSP70和COR15a）的表达，验证了mRNA-seq结果。
图2.野生型拟南芥植物中转录组对TuMV的反应。 （A）不同TuMV感染的DEG数量。 （B）DEG的GO分析（植物GOSlim）。 （C）植物激素相关基因的转录谱（log2倍变化），包括脱落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）。 （D）先天免疫相关基因的转录谱（log2倍数变化），包括PAMP触发的免疫（PTI）、效应子触发的免疫（ETI）和与发病相关的（PR）基因。
DEG中存在大多数RNA沉默相关基因（图3A）。另外大多数与DNA甲基化相关的DEGs均被抑制（图3A）。 RT- qPCR证实了BONSAI甲基化1（IBM1）和SILENCING 1（ROS1）表达的改变。有趣的是，进化分离株感染的植物的平均表达水平明显低于祖传病毒。因此，总体反应表明，在病毒感染期间DNA/组蛋白表观遗传调控层面上可能会发生变化。
由于几种表观遗传途径均以TEs为靶标，因此使用TE transcripts检查了TE家族的表达。5 dpi时在感染了进化分离株的植物中诱导产生了7个TEs，它们分别属于Gypsy和Copia家族，分别集中在着丝粒和着丝粒区域（图3B）。但是，在12 dpi时观察到了TE家族部分诱导部分抑制（图3B）。诱导的基因再次主要来自Gypsy和Copia家族；12 dpi时抑制的TEs包括Helitron、Harbinger和Mutator（MuDR）系列，它们通常位于靠近基因的位置（图3B）。进一步表明表观遗传因素可能在感染过程中起作用。
图3. TuMV感染的野生型拟南芥植物中表观遗传相关基因和转座子的转录谱。 （A）RNA沉默相关基因（黄色线条）和DNA甲基化相关基因（灰色线条）的转录谱（log2倍数变化）。 （B）用TEtranscripts工具获得的倍数变化（调整P <0.05）的热图。
TuMV适合性对表观遗传调控因子的影响
将两种TuMV分离株接种具有DNA /组蛋白甲基化的拟南芥突变体基因型，检测表观遗传因素在TuMV感染过程中起作用。结果表明主要参与对常染色体环境中小TEs调控的RdDM突变体，比野生型对TuMV的抗性更高（图4A）。其中ago4和rdr2分别是抗性最强和最弱的基因型，而poliv、polv和double drm1 drm2则呈现中等值。在ddm1突变体中也观察到抗性增强，尤其是对祖传病毒，该突变体缺乏TEs的主要调控因子（图4B）。
然而，组蛋白修饰突变体具有相反的作用。与野生型植物相比，H3K9组蛋白脱甲基酶ibm1突变体更容易受到进化分离株的影响（图4C）。另外H3K4组蛋白脱甲基酶JUMONJI 14（JMJ14）的突变体对病毒更具抵抗力（图4C）。
结果表明，感染性和症状严重程度的发展可能与染色质状态的改变有关，也支持了转录组的发现，即植物病毒防御机制可能需要表观遗传因子。
图4. TuMV感染表观遗传突变体，与Col-0野生型植物相比，表观遗传突变体中TuMV接种后每株植物（点）达到强烈症状的天数。（A）RdDM突变体。 （B）染色质重塑ddm1突变体。 （C）组蛋白修饰突变体。
祖传和进化分离株诱导的DNA甲基化变化相似但不相等
进一步在三个时间点（2、5和12 dpi）对祖传和进化的病毒感染植物进行了DNA甲基化测序（WGBS-seq）。分别针对三种胞嘧啶甲基化环境（CpG\CHG和CHH）分析了观察到的差异甲基化区域（DMR），并分为高甲基化和低甲基化。与转录组数据相反，祖先和进化分离株诱导的DMR数量在沿时间进程的相对均匀。
观察到大多数的CpG DMR被定位在蛋白质编码基因内（图5A和图5B）。但也观察到了靠近转录起始位点（TSS）CpG的DMR（图5A和图5B）。CHG和CHH DMR富含TEs（图5A和图5B）。在12 dpi的TE中，感染了进化病毒的植物的CHG DMR多了约2倍（图5A和图5B）。与转录谱一致，TE家族DMR最常见的是Gypsy、MuDR和Copia。因此，WGBS-seq 表明TuMV感染期间TE和基因中都存在DMR，这表明它们之间可能存在相互调节。
图5.受感染的野生型植物甲基化测序（WGBS）。 在基因（GbM）或TEs内靠近转录起始位点（TSS-prox）的3个胞嘧啶（CpG、CHG和CHH）中高甲基化或低甲基化的差异甲基化区域（DMR）的数量。 （A）祖传TuMV感染的植物。 （B）进化的TuMV感染植物。
祖传和进化分离株诱导的甲基化变化对转录组的影响相似
评估TSS近端DMR对蛋白质编码基因表达的影响，结果表明大多数具有TSS近端DMR的基因在任何时间点都不受感染的调节（图6A）。但是，观察到了TSS近端甲基化与表达之间负相关的情况，特别是12 dpi在CpG中（图6A）。这些基因主要包括RNA代谢（生物合成和加工）和蛋白质代谢（修饰和易位）有关的基因（图6B）。与氨基酸、碳水化合物、辅酶、脂质、核苷酸和次级代谢有关的基因也得到了富集，而与压力相关的基因很少与DMR呈负相关（图6B）。
由于CHG和CHH是转座子相关的主要甲基化标记，并且它们模式的变化会影响附近基因的表达，因此进一步分析非CpG DMR元件。结果表明5 dpi时，绝大多数受甲基调节的TE距离DEG都超过10 kb，这表明它们的调节不会影响附近基因的表达，或者它们位于基因丰富的区域之外（图6C）。但在12 dpi时观察到了大量接近DEG的受调节TE（图6C）。发现12 dpi包括PTI和ETI相关基因在内的约80个DES在两个分离株中都接近受调节的TEs。
讨论
病毒适应性通常用来定量描述特定宿主中病毒的繁殖能力和进化潜力。病毒利用各种细胞因子将基因表达模式重新编程，并阻止和干扰宿主细胞的防御。所有这些过程都在相互交织的互动和调控的复杂网络中进行，但病毒进化如何塑造和优化这些相互作用却很少受到关注。本文在DNA和组蛋白表观遗传修饰水平上对互作过程进行描述，结果表明病毒的侵染对甲基化模式和表观遗传调控基因的表达产生不同的影响。
本文使用了不同的方法来评估表观遗传因子在触发针对病毒的胁迫响应的影响。在利用表观遗传缺陷型突变体进行实验表明，包括RdDM因子AGO4、RDR2、POLIV、POLV和DMR1/2，DDM1和组蛋白修饰蛋白IBM1和JMJ14可以控制针对TuMV感染的反应（图4）。敲除RdDM、DDM1和JMJ14的植物显示出对该病毒的抗性，而ibm1突变体则更易感。之前研究表明SA介导的防御系统相关的基因，包括PR1，是在不同的RdDM或其他DNA（去）甲基化突变体中诱导的。另一方面，坏死性病原体受JA防御途径控制，在这些突变体中受到抑制。本文中转录组数据证明SA信号可能对TuMV应答很重要（图2C），因此在低甲基化突变体中SA介导的防御途径可能导致了抗性的变化。然而， RdDM效应可能不适用于植物病毒，因为已证明ago4突变体在感染后期更易感。在组蛋白修饰突变体中也观察到防御基因的错误表达，本文中IBM1和JMJ14在表达调控中具有拮抗作用。在ibm1突变体中异染色质增加可能会阻止或延缓防御基因的表达，可能导致了观察到的对TuMV的敏感性变化。相反，JMJ14从TE中去除了H3K4活性标记，在突变体中常染色质相关的标记增加。因此，jmj14中的防御基因可能比野生型植物中的启动基因更多，从而证实了观察到的抗性增加的现象。
在受感染的野生型拟南芥植物中观察到由于TuMV引起的基因和转座子及其周围甲基化模式的差异。大多数DMR位于CpG中，并定位在蛋白质编码基因的转录起始位点内部或周围（图5A，图5B）。但是，在其TSS周围具有DMR的基因的转录在很大程度上不受影响（图6A）。之前研究表明仅约5％的拟南芥基因受启动子甲基化的调控，可能无法确定启动子甲基化与表达之间的一般相关性。然而，观察到TuMV诱导的具有负甲基化和表达的基因，其中与RNA或蛋白质代谢有关的基因最多（图6B）。而甲基化程度与转录水平之间的关系应进一步证实。
2-5 dpi具有相似的甲基化水平，但是12 dpi时则表型为高甲基化（图5）。与转录组结果一致：12 dpi时TE被抑制，尤其是针对进化的TuMV分离株（图3B）。这可能是由于进化的分离株促进的更高的胁迫强度可能有助于更快的调控。尽管据报道，TEs的表观遗传调控可调控附近基因的表达，但TuMV诱导的TE调控的状态（高甲基化或甲基化不足）与附近基因调控的类型（诱导或抑制）之间没有明确的一般相关性。这种现象可能反映了感染时程的动态变化（图6C），但也可能是由于异染色质和拟南芥基因组较小所致。尽管如此，仍检测到一些接近具有非CpG DMR的TE的DEG，这表明可能存在共调节机制。至于启动子甲基化差异，应进一步采用其他实验方法验证其因果关系。
除表观遗传因素和已知的RNA沉默反应外，转录组数据还表明还存在针对TuMV的其他几种防御机制，包括光合作用的关闭、代谢重排以及与植物中所有已知免疫途径相关的基因的诱导（图2D）。与基于PTI和ETI的证据相符，表明植物-病毒互作中也具有保守的先天防御作用。
结论
表观遗传因素影响植物防御基因的表达，而越来越多的研究表明病毒侵染植物导致的应激过程可能会破坏表观遗传途径，进而导致基因转录水平的变化。本研究通过两种对拟南芥适应性不同的TuMV分离株，利用mRNA-seq和甲基化测序验证了表观遗传学是植物抗病毒防御调节的关键部分，同时利用表观遗传相关基因的拟南芥突变体的抗病性差异证实了上述结果，也证实这个过程受到宿主中病毒的适应性影响。本文的结论证实了DNA甲基化和组蛋白修饰途径是除了RNA沉默之外的抗病毒防御系统所必需的，为植物-病毒互作过程的相关研究提供了新的视角及有力的证据。
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