综述 | Development：从单细胞的角度理解胰腺β细胞的生成和再生（国人作品）
编译：夕夕，编辑：十九、江舜尧。
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了解β细胞生成和再生的背后机制是治疗糖尿病的关键。然而，传统的基于细胞群的研究方法在定义β细胞分化和反分化过程及相关的调节机制方面存在局限性。得益于单细胞技术的发展，使得研究人员能够对单个细胞进行研究，揭示中间细胞状态，细胞异质性等。本文，作者回顾了单细胞技术在体内和体外的β细胞生成和再生方面的最新进展，这些进展可以为优化糖尿病治疗方面提供帮助。
论文ID
原名：The Soybean Gene J Contributes to Salt Stress Tolerance by Up-Regulating Salt-Responsive Genes
译名：从单细胞的角度理解胰腺β细胞的生成和再生
期刊：Development
IF: 5.763
发表时间：2020.2
通讯作者：徐成冉
通讯作者单位：北京大学 北京-清华生命科学中心生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室
DOI号：doi:10.1242/dev.179051
介绍
胰腺是营养物质消化和维持血糖动态平衡的重要内部器官，其功能分别由外分泌室和内分泌室执行。外分泌室由分泌各种消化酶的腺泡细胞和将这些酶运输到十二指肠的导管细胞组成。内分泌室通过朗格罕细胞感知血糖的变化并执行调节功能。
糖尿病是一个全球性疾病，影响了约4.51亿人，给患者和社会带来了沉重负担。1型糖尿病（T1D）占病例的5-10%，是由于免疫系统对β细胞的攻击导致胰岛素分泌不足所致。2型糖尿病（T2D）更为常见，是由于周围组织的胰岛素抵抗引起的。目前，减轻糖尿病症状的主要方法是胰岛移植和外源性胰岛素注射，但这两种方法分别具有供体不足和葡萄糖控制不准确的缺点。功能性β细胞或胰岛的可持续来源代表了改善糖尿病治疗的有前途的方法。β细胞的来源包括：β细胞的内源性再生；非β细胞可塑性和转分化为分泌胰岛素的细胞；人胚胎干细胞对β细胞的诱导和外源性诱导。为了成功生成成熟的β细胞或体外构建完整的胰岛，研究人员必须了解关于胰腺内分泌谱系发育和成熟的途径和调控机制。为了通过促进β细胞增殖或将非β细胞转分化为分泌胰岛素的细胞来诱导β细胞内源性再生，研究人员必须了解这些群体中细胞异质性的水平，调节细胞可塑性的机制以及分子内分泌谱系之间的关系。所有这些努力将促进糖尿病细胞疗法的发展。
在过去几十年中，对动物模型和人体标本的研究进一步加深了研究人员对β细胞发育和再生的理解，从而有了关于糖尿病治疗中的进步。但是，关于胰腺内分泌细胞的分子特征还不是十分清楚。幸运的是，得益于单细胞技术的最新发展，研究人员已经能够在单细胞水平上重新检查内分泌细胞的发育和再生调控。单细胞技术非常适合研究胰腺等复杂器官，并有助于绘制每个细胞谱系的发育轨迹，这将使研究人员进一步了解细胞命运决定的调控。
近年来已经开发了许多单细胞方法（表1）。其中，单细胞转录组测序（scRNA-seq）已普遍用于发育和再生生物学。不同的scRNA-seq方法已应用于：描述细胞亚群和细胞异质性；在细胞群体中鉴定新的标记基因等（箱1）。
主要内容
胰腺发育
在啮齿动物中，胰腺来自两个地方（背侧和腹侧内胚层），分别在胚胎期9.0日和9.5日对周围组织的不同信号做出反应，形成背侧和腹侧的胰腺芽（图1）。这些芽由表达Pdx1的多能祖细胞（MP）组成。随后，MP细胞分化为尖端和双能干细胞。顶细胞进一步分化为腺泡细胞，而干细胞分化为导管或内分泌细胞。干细胞的细胞命运测定受Neurog3（Ngn3）调节，Neurog3是形成内分泌祖细胞（EPs）的关键转录因子（TF）。胰腺发育经历两个过渡期：第一波过渡期（从E9.5-E12.5开始），在此期间形成的内分泌细胞主要是表达Gcg的细胞或多激素细胞，第二波过渡（从E12.5到出生），这是内分泌细胞形成的主要时期。
在啮齿动物模型中进行的遗传研究揭示了胰腺谱系分化的主要框架，并确定了许多重要因素，这些重要因素涉及调节胰腺谱系分化的关键步骤。但是，基于细胞群体和有限标记基因的传统研究可能掩盖细胞异质性，并掩盖参与细胞谱系分化的中间祖细胞。因此，这些局限性影响了细胞分化途径及其潜在调控机制的研究。因此，以单细胞分辨率研究胰腺发育过程可以指导研究人员更全面地了解胰腺器官发生。
与对啮齿动物胰腺发育的了解相比，研究人员对人类胎儿胰腺发育知之甚少。人的胰腺也来源于背侧和腹侧内胚层结构。背芽在受孕后26 dpc（受孕后一天）被检测到，而腹芽在约30 dpc处被检测到。妊娠6-8周之间的肠道旋转会融合芽。通常，人类胰腺的谱系层次和分子特征与小鼠非常相似，人类胰腺发育的细节已在其他地方进行了评论。简而言之，PDX1+MP细胞分离到尖端和躯干隔间，内分泌细胞是通过瞬时NGN3+状态从双能干细胞产生的。
NGN3缺乏会导致人类内分泌细胞的丢失或减少。重要的是，某些关键TF的功能在调节人与小鼠之间的细胞身份方面是保守的：α细胞形成需要ARX，β细胞在成年胰岛中特异性表达NKX6-1。但是，人类和小鼠的胰腺发育之间确实存在物种差异。例如，NKX2-2在人类中位于NGN3的下游，但在小鼠中位于Ngn3的上游。
值得注意的是，如果将啮齿动物模型得出的结论应用于人类发育中时，研究人员应审慎行事。因此，确定人类胰腺谱系发育的图谱对于研究人员了解人类胰腺的发育过程和调控机制至关重要。但是，由于人体组织的稀缺性，可以将具有与人类相似的生理学的大型动物模型（例如猪和非人类灵长类动物）用作人类胰腺研究的替代模型。接下来，作者回顾了啮齿动物模型和人类胰腺发育的单细胞转录组学研究。
尽管MP细胞的产生发生在胰腺发生的最早阶段，并且MP细胞不是内分泌谱系的直接祖细胞但是高质量MP细胞的生成是获得功能性内分泌β细胞的关键之一。为了了解小鼠背侧和腹侧胰腺区域的MP细胞分化，已在E9.5和E10.5的两个区域的Pdx1+细胞上进行了scRNA-seq。这些分析表明，Pdx1+细胞是异质的，可以在背侧和腹侧区域分化为Pdx1low和Pdx1high。在腹侧区域，Pdx1low细胞代表将成为成肝细胞，肝外胆管（EHBDs）和Pdx1high MP细胞的中间MP。但是，在背侧区域，Pdx1low细胞是内分泌细胞的第一波，而Pdx1high细胞是MP细胞，推测它们直接与内胚层细胞分化（图1）。
随后，MP细胞开始向外分泌和内分泌谱系逐步分化。作者最近的工作已使用各种小鼠谱系通过E9.5-E17.5背胰腺的scRNA-seq综合绘制了外分泌和内分泌（α和β细胞）谱系的多步发育轨迹。沿着这种胰腺谱系分化轨迹，作者确定了祖细胞经历命运变化的几种中间细胞状态和分支点（图1）。从其研究结果可以看出，根据MP细胞出现的时间可以分为MP早期和MP晚期细胞。
2. EP细胞的分化和异质性
由于内分泌胰腺谱系（尤其是α和β细胞谱系）负责血糖的动态平衡，因此与用于治疗的转化医学有关，因此大多数单细胞研究都集中在内分泌发生上（表2）。几个研究组织对胰腺内分泌的产生过程进行了研究，发现小鼠的EP具有异质性，特征基因表达具有动态变化，并且在分化为不同的胰岛谱系方面具有暂时性。根据作者的 scRNA-seq研究，EPs被定义为从双潜能主干细胞中分化出来的细胞并表达的一组标记基因，但尚未表达激素基因。作者的研究表明，EPs的快速命运转移可分为四个发育阶段(EP1-EP4)，涉及一系列TFs的基因级联表达（图1）。与一小部分Ngn3低表达的主干细胞相比，EP1中Ngn3表达升高，EP2中达到峰值，EP3中下降，EP4中恢复到背景水平，Neurod1开始在EP2细胞中表达。EP4群体作为一个分支节点生成α和β细胞。
多项研究表明EP细胞的发育和异质性在染色质水平上受到调节。作者的工作揭示了组蛋白脱甲基酶Jmjd3（Kdm6b）在EP细胞过渡过程中的调节作用。作者使用Ngn3-GFP敲入小鼠品系来纯化Ngn3-GFPlow和Ngn3-GFPhigh细胞胰腺，Jmjd3的基因敲除损害了EP细胞从Ngn3-GFPlow到Ngn3-GFPhigh状态的转变以及随后的胰岛形成。使用scRNA-seq，作者发现Jmjd3仅影响从Ngn3-GFPlow转变为Ngn3-GFPhigh的效率，而没有改变Ngn3high细胞的转录组和发育途径。使用scRNA-seq，作者已显示小鼠Ngn3+细胞异质表达Myt1，其编码参与调节内分泌胰岛细胞分化和功能的TF。Myt1+Ngn3+细胞高度表达DNA甲基转移酶1（Dnmt1），从而导致Arx增强子区域的DNA甲基化水平更高，而Arx是α细胞分化的关键TF。因此，在Myt1+ Ngn3+细胞中Arx的表达受到抑制。此外，在E14.5和E16.5处的小鼠Ngn3表达细胞在转录组和染色质可及性上显示出差异。
综上所述，这些研究揭示了内分泌发生过程中EP细胞的异质性。然而，由不同的scRNA-seq平台产生的EP细胞的分类并不统一。这些数据集的综合分析可能会确定这些分类之间的对应关系。EP细胞的异质性可能反映了它们对特定内分泌谱系的分化能力或趋势，这可能在不同的发育时期受到表观遗传调控。此外，将scRNA-seq分析与传统的遗传，表观遗传和成像方法相结合已成为胰腺发育生物学的新趋势，并提供了解决这些问题的有用工具。
由于人类胎儿样品的稀缺性，对人类胎儿胰腺发育的研究受到限制，并导致高估了小鼠和人类之间的谱系等级和转录组的保守性。有研究人员使用单细胞qPCR，从人类胎儿胰腺发育的第9周开始，对四个具有细胞表面标志物富集的种群（种群A-D）中的91个基因的转录谱进行了分析。通过这种方法，他们揭示了每个群体的细胞组成和内分泌细胞的分支分化途径。A和B主要包括胰腺祖细胞，C包含EP细胞，D由内分泌细胞组成。重要的是，这项工作描述了9个人胰腺中从胰腺祖细胞到内分泌细胞的连续发育过程，并为通过单细胞方法探索人胎儿胰腺谱系的发育轨迹和调控机制提供了示例。未来的工作应集中在使用scRNA-seq结合其他方法对人胎儿胰腺发育进行全面而公正的评估。
在胚胎发育过程中，不成熟的内分泌细胞发育成功能性内分泌细胞。大多数研究都集中在成熟的β细胞，因为其对糖尿病治疗的作用。不成熟的β细胞是高度增殖和对葡萄糖刺激反应不佳。产后发育是β细胞成熟的关键时期，在此期间它们获得生理功能，例如响应细胞外葡萄糖而产生葡萄糖刺激的胰岛素分泌。此外，TFs Mafb和Mafa分别在小鼠未成熟和成熟的β细胞中表达，这种转化是小鼠β细胞发育的重要特征。然而，与小鼠不同，MAFB在成年人类β细胞中不断表达。在人类胰腺发育过程中，在15 WD后表达葡萄糖敏感蛋白的β细胞比例增加。在啮齿动物中，断奶促使了β细胞的出生后成熟，研究表明，miRNA在调节出生后β细胞的成熟中起着核心作用。此外，已经提出了诸如哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR），AMP活化蛋白激酶（AMPK）和WNT的信号传导途径来调节β细胞成熟，但是还需要进一步研究。
单细胞水平的最新研究拓宽了研究人员对β和α谱系细胞异质性，增殖和成熟的理解。单细胞转录组学分析揭示了在内分泌谱系成熟过程中增殖细胞相对于静止细胞或不成熟细胞相对于成熟细胞特异性表达的基因。排除与细胞周期相关的基因，增殖性β细胞表现出与静止的β细胞相似的转录组特征，并与假时态成熟过程保持同步。此外，产前和幼年（而非成年）β细胞在成熟状态中表现出异质性。此外，对α细胞的成熟途径和伴随的基因表达动态的研究表明，在成熟过程中β细胞和α细胞使用不同的调控策略：α细胞在成熟过程中倾向于下调基因表达，而β细胞成熟则伴随着β细胞的上调。
总的来说，scRNA-seq已被用于系统的研究小鼠各个阶段胰腺谱系的发育，这些发现可能为改善和评估hESC诱导效率提供了见解。但是，在将这些结论推论到人类胰腺发育时，我们必须谨慎。因此，当前重要的是要解决人类胰腺谱系的发育过程。
刺激β细胞的增殖是用于糖尿病治疗的β细胞内源性再生的直接方法。β细胞在出生后的早期阶段经历了大量增殖，随后增殖和功能成熟度下降。成人β细胞的增殖相对较慢，但在某些生理条件下，例如肥胖和妊娠，可能会发生增殖爆发，以增加胰岛素分泌并满足高代谢需求。这些发现表明，至少一部分β细胞具有适应不断变化的微环境以维持体内平衡的灵活性。因此，利用β细胞增殖和功能上的异质性可能会为特异性和可控制地刺激β细胞增殖的治疗方法的发展提供信息。基于单细胞技术的研究扩展了研究人员对内分泌细胞（尤其是β细胞）增殖和异质性的认识。
当β细胞处于未成熟状态时，β细胞增殖主要发生在围产期。因此，未成熟和成熟的β细胞的比较有望提供有关增殖的分子机制的线索，包括关键的调控基因和信号通路。在单细胞转录组和蛋白质组学水平上，无论是小鼠还是人类，β细胞的增殖率都会随着年龄的增长而下降。此外，氨基酸代谢和线粒体活性氧（ROS）在促进小鼠出生后β细胞增殖中起重要作用。
很多研究机构均报道了β-细胞异质性。然而，不同研究之间“异质性”的分类是不一致的。针对ST8SIA1和CD9的抗体可以将人类β细胞分类为具有不同基因表达谱和GSIS功能的四个抗原亚群。多项scRNA-seq分析显示，人的β细胞在成熟过程中以及对代谢压力的反应均具有异质性。通过在小鼠完整的胰腺组织中使用单分子荧光原位杂交（smFISH），有研究人员已经鉴定出一小部分“极端”β细胞，它们表达更高水平的胰岛素和其他分泌基因的mRNA。这些细胞含有较高的核糖体RNA和胰岛素原，但胰岛素蛋白较低，表明它们可能是基础分泌物。在未来的研究中，将需要稳定且高通量的方法以及更大的样本量来更详细地检查β细胞异质性。综上所述，这些研究表明，β细胞的增殖能力和对压力和代谢需求的功能反应表现出异质性。
导管和腺泡细胞的异质性和相应的可塑性值得进一步研究，因为这些细胞被认为是体内细胞命运转化为β细胞的丰富来源。已经鉴定出导管细胞的两个亚群，其显示粘蛋白1（导管细胞标记物MUC1）和囊性纤维化跨膜电导调节剂（CFTR，分泌细胞标记物）的反向表达模式，这是与CFTR在导管中异质表达的发现相符。值得注意的是，表达MUC1高和CFTRlow的种群位于导管末端，而反向种群位于连接腺泡和导管细胞的区域。有研究人员使用一种基于良好的Smart-seq2方法，鉴定了人类的两个腺泡细胞簇：簇1，炎症相关基因的表达升高；簇2，其高表达分泌型消化酶编码基因。但是，另有人使用CEL-Seq2方法鉴定了四个人腺泡细胞簇。
在未来的研究中使用scRNA-seq将有助于重新检查细胞命运转换过程，并解决先前研究中有争议的结论。scRNA-seq将捕获罕见的转化中间细胞状态，描述其全面的动态基因表达图谱，使沿着细胞状态转变的轨迹作图，并确定体内或体外的重要调控驱动因子。更深入的了解将使我们能够利用细胞的异质性和可塑性来优化再生策略。此外，要精确模拟转化为分泌胰岛素的β样细胞的转化，研究人员必须首先了解胰腺中每种细胞类型的分子特征以及在各种条件下在单细胞水平上发生的相应动态变化。最后，对非β胰腺细胞类型的转录谱和异质性进行解码将有助于建立系统框架，以概括细胞谱系之间的全面关系。
总结
随着高分辨率技术的发展，人类已经进入了了解单细胞水平器官发生的新时代。在本综述中，作者总结了单细胞技术（主要是scRNA-seq）的使用，为β细胞生成和再生领域的研究提供了信息。scRNA-seq已广泛应用于胰腺发育，以全面描述小鼠的谱系图片。 但是，有必要确定基于伪时间分析的推断发展轨迹是否反映了真实的发展轨迹。这些发现为深入了解hESCs的β细胞再生策略提供了见解。另外，scRNA-seq可以鉴定成年人的胰腺细胞状态和异质性，以更好地了解某些细胞类型的增殖能力和功能潜能。此外，scRNA-seq研究有望扩展研究人员对细胞可塑性的了解，并确定细胞命运的转化途径。然而，由不同的scRNA-seq平台得出的不同结论应通过与其他方法（如显微镜和CRISPR编辑）的协同作用进一步验证。总体而言，基于单细胞技术的研究已经重构了胰腺发育的框架，并为未来的机理研究奠定了基础。
新的单细胞技术的组合应用将从多组学的角度更清楚地了解胰腺。尽管已通过scRNA-seq定义了胰腺细胞的身份，但基因表达并不能表明细胞功能。因此，单个细胞中的蛋白质表达模式可以告知细胞功能和可塑性的异质性。更重要的是，在胰腺发育和再生过程中，需要从表观遗传学角度描述多步细胞命运选择和转变的调控机制。因此，单细胞蛋白质组学和表观遗传学研究将补充由scRNA-seq建立的胰腺谱系分化的框架，并为再生医学提供依据。
在scRNA-seq研究中鉴定出的许多与糖尿病相关的基因并没有重叠，这可能是由于个体的糖尿病致病性复杂，供体样品数量有限或使用 不同的技术平台。为了更好地利用单细胞技术生成的数据集，未来的研究需要依靠更敏感，通量更高的实验方法，新颖的生物信息学分析工具以及更大样本量的开发。
总的来说，单细胞技术扩展了研究人员对胰腺发育和再生的复杂过程的理解，并为药物筛选和糖尿病治疗提供了新颖的见解。在不久的将来，随着单细胞技术的不断发展，研究人员将对胰腺内分泌的发育和再生的过程和机制有更全面和深入的了解，从而为体外人胰岛组织的生产提供信息。
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