科研 | 浙江大学：野外和人工冷驯化的越冬常绿植物之间的比较转录组学研究（国人佳作）
编译：Mr. Left，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
实验设计
结果
LFT定义为造成50％伤害的温度，即LT50。在实验I（图1A）中，10月26日（日平均气温约为22°C（图1B），光周期为11.2 h（图1C））的LT50为-4.3°C（图1D）。在进行人工冷驯化处理之前，实验II和III（温度为25°C，日长为16 h（图1A））的室内植物处于营养生长状态（即，人工非驯化，A-NA）（图S1），叶片LT50（即0天处理）为-4.2°C（图1D）。在本研究中，尽管叶片可能会在10月26日之前对缩短的光周期做出响应（图S2），作者将10月26日的样本视为野外非驯化样本（即野外非驯化，F-NA），这是由于LFT与叶片的营养生长相似。
通常，在实验I中，从10月26日到1月20日，LFT随着气温和光周期的降低而增加，并且在1月20日，野外叶片组织通过完全CA获得了最强的LFT（即野外冷驯化，F-CA）（LT50为-18.5°C）（图1D）。在4°C（人工冷驯化，A-CA）或4°C加紫外线B（UVB）（经过UVB处理的人工冷驯化，A-CA + UVB）进行56天处理后，LFT增加到-10°C（图1D）。
在实验Ⅰ中叶片花青素含量逐渐增加，但在实验Ⅱ中没有显著变化（图1E，图S3）。在实验III中，花青素在14天处理后开始增加（图1E，图S3），并且在56天处理后的浓度约为实验I 1月20日浓度的一半（图1E）。结合实验II和III中的LFT数据，由花青素本身增加的LFT尚不清楚。
2 在野外和人工CA期间的转录组测序，主成分分析（PCA）和鉴定的差异表达基因（DEG）
根据LFT和花青素的生理变化，选择了5个样品进行转录组学分析，每个样品都有3个生物学重复（图1A）。总共鉴定出94144个独立基因，N50为1800。所有的独立基因都用于进行PCA分析（图2A），表现为1）每个样品中生物学重复的相似性是有效的；2）主成分1将CA与非驯化区分开，主成分2将野外CA与人工CA区分开；3）F-NA和A-NA之间的距离表明，早秋和营养生长期间叶片的状态不同。
实验I（F-NA与F-CA），II（A-NA与A-CA）和III（A-NA与A-CA + UVB）分别有3023、1235和2620个带注释的DEG（图2B）。在三个成对比较中共鉴定出438个DEG（图2B），并且在实验I，II和III中分别上调或下调了2229、122、1259个DEG（图2B）。实验I，II和III分别富集了23、26和31条KEGG通路（p <0.05）（图2C）。实验I中特异地富集了八条途径，包括涉及光合作用或光保护的4种途径（KO00195，KO00196，KO00906，KO04146）和涉及脂肪酸代谢的2种途径（KO00591和KO00592）。在三个实验中普遍富集了11条途径，包括涉及碳水化合物代谢的5条途径（KO00040，KO00053，KO00500，KO00630，KO01200），属于次级代谢的3条途径（KO00904，KO00940，KO00941），与氨基酸代谢有关的1条途径（KO00410），与脂质代谢有关的1条途径（KO00071）和与昼夜节律有关的1条途径（KO04712）（图2C）。这两个关键的KEGG通路组为本研究提供了探索完整CA机制的信息。
图2基于RNAseq鉴定的所有独立基因的主成分分析。PC1，主成分1；PC2，主成分2。每种处理均包含三个生物学重复。B在实验I（F-NA与F-CA），II A-NA与VA-CA）和III（A-NA与A-CA + UVB）中通过RNAseq识别注释的差异表达基因（DEG，log2倍数变化≥2，错误发现率<0.01）的维恩图分析。C 基于实验I（F-NA与F-CA），II（A-NA与A-CA）和III（A-NA与A-CA + UVB）中B中的DEG的KEGG途径的维恩图分析（p ＜0.05）。F-NA，于2015年10月26日在实验I中采样；F-CA，于2016年1月20日在实验I中采样；A-NA，实验II和III中的0天样本；A-CA，实验II中的56天样本；A-CA + UVB，实验III中的56天样本（见图1A）。
3 A-NA与F-NA的差异表达基因（DEG）富集的KEGG通路
为了了解两个未驯化样品之间的差异，进行了A-NA与F-NA的比较。与A-NA相比，F-NA中总共有1849个带有注释的DEG，并且1119个被上调和730个被下调。在这些DEG中，有84个被富集到9条KEGG途径（p <0.05）（表1）。20个DEG被富集到KO04075“植物激素信号转导”，其中包括5个编码“脱落酸（ABA）响应元件结合因子（ABF）”或“高ABA诱导的PP2C/蛋白磷酸酶2C（PP2C）”的DEG被上调（表1）。在ABA存在的情况下，ABA与PYR/PYL/RCAR受体结合进而与PP2C结合，从而激活SnRK2激酶，这促进了ABA信号转导至下游转录因子（ABF）。ABF和PP2C对ABA有响应，这表明F-NA中的ABA水平高于A-NA。该推论在图3中得到证明。F-NA的ABA水平（即，图3C中的2015年10月26日）是A-NA的3倍（即，图3C中的0 d）。3个编码“含茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白（JAZ）”的DEG被上调或下调（表1）。JAZ蛋白是将JA生物合成与激素诱导的变化联系起来的核心信号传导链的组成部分。JAZ是响应茉莉酸（JA）处理而诱导的。因此，与A-NA（表1）相比，在F-NA中具有高转录水平的两个JAZ上调（表1）表明JA在F-NA中的积累。该假设在图4中得到证明，其中F-NA的JA含量约为A-NA的2.5倍（图4C）。20个DEG被富集到KO04626的“植物-病原体相互作用”，其中4个编码“钙结合蛋白”的DEG和2个编码“钙依赖性蛋白激酶”的DEG被上调；4个编码“钙调蛋白”的DEG被上调或下调（表1）。ABA处理后，第二信使（例如Ca2+）在细胞中积累，然后促进一系列信号转导。据报道，Ca2+和钙调蛋白也参与JA生物合成。此外，编码“WRKY转录因子33”的2个DEG被上调。以前的研究表明，WRKY33是一种早期的冷诱导转录因子。6个DEG被富集到KO04712“昼夜节律植物”中，其中1个编码转录因子LHY的DEG被下调（表1），这表明A-NA和F-NA在温暖温度下的光信号差异会干扰植物的内源性时钟。以上所有信息表明A-NA和F-NA的生理状态不同，并且ABA-，JA-和Ca2+-相关信号在早秋被激活。
表1富集在KEGG途径的A-NA与F-NA的差异表达基因（DEG）（p <0.05）。
|
# ID |
FPKM |
FDR |
Log2FC |
KEGG annotation |
|
|
A-NA |
F-NA |
||||
|
c153823.graph_c0 |
4.34 |
25.28 |
3.05E-13 |
3.26 |
ABA responsive element binding factor ABSCISIC ACID-INSENSITIVE |
|
c151546.graph_c1 |
8.60 |
20.00 |
4.51E-10 |
2.06 |
5-like protein 7; ABA responsive element binding factor |
|
c158181.graph_c0 |
2.05 |
13.52 |
7.42E-07 |
3.15 |
Highly ABA-induced PP2C gene 3, putative [EC:3.1.3.16] |
|
c164257.graph_c0 |
5.61 |
23.94 |
0.000369525 |
2.42 |
Protein phosphatase 2C [EC:3.1.3.16] |
|
c164257.graph_c5 |
6.76 |
22.81 |
2.34E-09 |
2.35 |
Highly ABA-induced PP2C [EC:3.1.3.16] |
|
c160920.graph_c0 |
43.28 |
370.14 |
9.54E-20 |
3.66 |
Jasmonate ZIM domain-containing protein |
|
c161904.graph_c1 |
87.17 |
477.82 |
1.11E-16 |
2.95 |
Jasmonate ZIM domain-containing protein |
|
c167186.graph_c0 |
0.96 |
0.00 |
0.003017481 |
↓ |
Jasmonate ZIM domain-containing protein |
|
c155299.graph_c0 |
5.90 |
693.66 |
2.92E-67 |
7.35 |
Xyloglucan: xyloglucosyl transferase TCH4 [EC:2.4.1.207] |
|
c111083.graph_c0 |
0.31 |
8.88 |
1.24E-11 |
5.54 |
Xyloglucan: xyloglucosyl transferase TCH4 [EC:2.4.1.207] |
|
c156940.graph_c0 |
0.67 |
10.32 |
3.44E-19 |
4.41 |
Two-component response regulator ARR-A family |
|
c152475.graph_c0 |
13.54 |
102.73 |
4.05E-29 |
3.35 |
SAUR family protein |
|
c160607.graph_c1 |
27.80 |
105.51 |
1.18E-15 |
2.38 |
Auxin-responsive protein IAA |
|
c162578.graph_c0 |
17.01 |
37.31 |
0.000614998 |
2.03 |
Ethylene-responsive transcription factor 1B-like |
|
c156981.graph_c0 |
63.34 |
11.22 |
1.36E-11 |
-2.00 |
EIN3-binding F-box protein |
|
c141654.graph_c0 |
23.16 |
3.86 |
1.31E-07 |
-2.04 |
SAUR family protein |
|
c137962.graph_c0 |
30.17 |
3.48 |
0.003927416 |
-2.38 |
Auxin-induced protein 15A-like; SAUR family protein |
|
c142595.graph_c0 |
5.69 |
0.89 |
0.001078627 |
-2.56 |
Auxin-induced protein X15; SAUR family protein |
|
c155123.graph_c0 |
4.47 |
0.22 |
4.80E-11 |
-3.72 |
Auxin responsive GH3 gene family |
|
c94049.graph_c0 |
0.58 |
0.00 |
0.007407413 |
↓ |
ETHYLENE INSENSITIVE 3-like 1 protein; Ethylene-insensitive protein 3 |
|
KO04626 Plant-pathogen interaction |
|||||
|
c164601.graph_c0 |
20.08 |
289.12 |
1.06E-37 |
4.60 |
Calcium-binding protein CML |
|
c161728.graph_c0 |
0.89 |
6.73 |
2.93E-05 |
3.71 |
Calcium-binding protein CML |
|
c164763.graph_c2 |
7.58 |
23.62 |
4.22E-07 |
2.17 |
Calcium-binding protein CML |
|
c148960.graph_c0 |
28.02 |
80.29 |
1.07E-06 |
2.04 |
Calcium-binding protein CML |
|
c157733.graph_c1 |
23.77 |
2.55 |
7.95E-14 |
-2.70 |
Calcium-binding protein CML |
|
c151289.graph_c2 |
1.32 |
26.83 |
1.65E-38 |
4.88 |
Calcium dependent protein kinase [EC:2.7.11.1] |
|
c151289.graph_c3 |
2.16 |
34.11 |
4.08E-40 |
4.51 |
Calcium-dependent protein kinase [EC:2.7.11.1] |
|
c164745.graph_c2 |
0.59 |
71.27 |
8.00E-83 |
7.43 |
Calmodulin-like protein 5, CML |
|
c161698.graph_c0 |
3.47 |
18.08 |
1.34E-11 |
2.90 |
Calmodulin-like protein 5-like |
|
c166448.graph_c0 |
3.64 |
0.00 |
1.60E-07 |
↓ |
Calmodulin-like protein 4-like |
|
c167516.graph_c0 |
0.80 |
0.00 |
0.003178771 |
↓ |
Calmodulin-related protein |
|
c155156.graph_c1 |
4.95 |
16.30 |
2.87E-08 |
2.13 |
WRKY transcription factor 33 |
|
c151364.graph_c0 |
22.56 |
65.81 |
3.77E-12 |
2.08 |
WRKY transcription factor 33 |
|
c156941.graph_c0 |
23.81 |
45.82 |
3.83E-14 |
2.27 |
WRKY transcription factor 22-like |
|
c133104.graph_c0 |
0.76 |
15.44 |
5.02E-10 |
5.34 |
Pathogenesis-related genes transcriptional activator PTI4 |
|
c137960.graph_c1 |
1.64 |
4.67 |
0.005026481 |
2.14 |
Serine/threonine-protein kinase PBS1 [EC:2.7.11.1] |
|
c156873.graph_c1 |
83.53 |
251.28 |
8.40E-12 |
2.12 |
Mitogen-activated protein kinase 1/3 [EC:2.7.11.24] |
|
c163495.graph_c1 |
44.99 |
7.19 |
8.73E-08 |
-2.16 |
Molecular chaperone HtpG LRR receptor-like |
|
c153546.graph_c0 |
7.02 |
0.84 |
1.77E-10 |
-3.94 |
serine/threonine-protein kinase EFR [EC:2.7.11.1] |
|
c151512.graph_c0 |
1.18 |
0.00 |
0.001878043 |
↓ |
Molecular chaperone HtpG |
|
KO04712 Circadian rhythm – plant |
|||||
|
c165611.graph_c1 |
191.21 |
10.07 |
5.52E-19 |
-2.91 |
Protein LHY-like; K12133 MYB-related transcription factor LHY |
|
c160949.graph_c1 |
4.02 |
49.92 |
5.15E-27 |
4.04 |
Pseudo-response regulator 1 |
|
c152231.graph_c0 |
10.42 |
109.42 |
1.55E-37 |
3.90 |
Two-component response regulator-like APRR1; Pseudo-response regulator 1 |
|
c165938.graph_c0 |
17.76 |
2.31 |
2.38E-14 |
-2.45 |
Pseudo-response regulator 5 |
|
c147299.graph_c0 |
5.38 |
0.48 |
1.18E-06 |
-2.93 |
E3 ubiquitin-protein ligase RFWD2 [EC:6.3.2.19] |
|
c162557.graph_c0 |
2.35 |
0.24 |
0.000241722 |
-3.38 |
Chalcone synthase [EC:2.3.1.74] |
|
KO00500 Starch and Sucrose metabolism |
|||||
|
c164787.graph_c0 |
10.74 |
93.30 |
1.34E-11 |
3.65 |
Beta-amylase [EC:3.2.1.2] |
|
c157317.graph_c0 |
1.30 |
10.64 |
1.51E-21 |
3.51 |
Pectinesterase [EC:3.1.1.11] |
|
c161785.graph_c0 |
8.27 |
51.99 |
2.74E-26 |
3.13 |
Galacturonosyltransferase 10 [EC:2.4.1.43] |
|
c162045.graph_c2 |
0.21 |
1.20 |
0.002486874 |
3.07 |
Beta-fructofuranosidase [EC:3.2.1.26] |
|
c155814.graph_c2 |
0.50 |
2.40 |
0.001399201 |
2.83 |
Beta-glucosidase [EC:3.2.1.21] |
|
c153525.graph_c0 |
22.30 |
110.18 |
3.16E-20 |
2.79 |
Beta-amylase [EC:3.2.1.2] |
|
c165671.graph_c0 |
12.69 |
50.86 |
6.37E-20 |
2.67 |
UDP glucose 6-dehydrogenase [EC:1.1.1.22] |
|
c164671.graph_c1 |
10.81 |
47.70 |
4.52E-10 |
2.67 |
Trehalose 6-phosphate phosphatase [EC:3.1.3.12] |
|
c162729.graph_c0 |
7.14 |
27.61 |
1.04E-16 |
2.44 |
Alpha-1,4-galacturonosyltransferase [EC:2.4.1.43] |
|
c159964.graph_c0 |
0.73 |
1.91 |
0.000385822 |
2.19 |
Pectinesterase [EC:3.1.1.11] |
|
c162426.graph_c0 |
47.72 |
143.70 |
2.75E-11 |
2.16 |
4-alpha-glucanotransferase [EC:2.4.1.25] |
|
c146859.graph_c0 |
5.74 |
0.97 |
4.34E-06 |
-2.28 |
Cellulase family protein; Endoglucanase [EC:3.2.1.4] |
|
c142791.graph_c0 |
0.75 |
0.04 |
0.003372579 |
-3.67 |
Glucose-6-phosphate isomerase [EC:5.3.1.9] |
|
c102813.graph_c0 |
0.58 |
0.02 |
0.005274354 |
-4.34 |
Hexokinase [EC:2.7.1.1] |
|
c111830.graph_c0 |
0.43 |
0.00 |
0.000734641 |
↓ |
1,4-alpha-glucan branching enzyme [EC:2.4.1.18] |
|
c132788.graph_c1 |
0.66 |
0.00 |
0.009671532 |
↓ |
Beta-amylase [EC:3.2.1.2] |
|
c88221.graph_c0 |
2.63 |
0.00 |
1.58E-13 |
↓ |
Beta-amylase 3, chloroplastic [EC:3.2.1.2] |
|
c88616.graph_c0 |
0.88 |
0.00 |
4.94E-05 |
↓ |
Sucrose synthase [EC:2.4.1.13] |
|
KO04070 Phospharidylinositol signaling system |
|||||
|
c164039.graph_c0 |
9.84 |
155.66 |
1.09E-36 |
4.48 |
Phosphoinositide phospholipase C 2-like [EC:3.1.4.11] |
|
c165201.graph_c1 |
5.03 |
48.46 |
3.21E-35 |
3.74 |
Diacylglycerol kinase (ATP) [EC:2.7.1.107] |
|
c157888.graph_c0 |
5.25 |
58.13 |
1.70E-33 |
3.61 |
Phosphatidylinositol phospholipase C, delta [EC:3.1.4.11] |
|
c161698.graph_c0 |
3.47 |
18.08 |
1.34E-11 |
2.90 |
Calmodulin-like protein 5-like |
|
c101046.graph_c0 |
1.62 |
0.00 |
2.56E-05 |
↓ |
Calmodulin |
|
c166448.graph_c0 |
3.64 |
0.00 |
1.60E-07 |
↓ |
Calmodulin-like protein 4-like |
|
c167516.graph_c0 |
0.80 |
0.00 |
0.003178771 |
↓ |
Calmodulin-related protein |
|
KO00052 Galactose metabolism |
|||||
|
c98449.graph_c0 |
0.73 |
37.07 |
1.03E-09 |
6.78 |
Galactinol synthase 2-like; Inositol 3-alpha-galactosyltransferase [EC:2.4.1.123] |
|
c155311.graph_c2 |
8.87 |
174.39 |
1.27E-09 |
4.85 |
Galactinol synthase 2; Inositol 3-alpha-galactosyltransferase [EC:2.4.1.123] |
|
c162045.graph_c2 |
0.21 |
1.20 |
0.002486874 |
3.07 |
Acid invertase; Beta-fructofuranosidase [EC:3.2.1.26] |
|
c162841.graph_c0 |
102.65 |
410.29 |
0.002305512 |
2.47 |
Raffinose synthase [EC:2.4.1.82] |
|
c102813.graph_c0 |
0.58 |
0.02 |
0.005274354 |
-4.34 |
Hexokinase [EC:2.7.1.1] |
|
c137892.graph_c0 |
0.46 |
0.00 |
0.001043418 |
↓ |
Stachyose synthetase [EC:2.4.1.67] Galactinol synthase 2; Inositol |
|
c156367.graph_c0 |
2.53 |
0.00 |
1.03E-10 |
↓ |
3-alpha-galactosyltransferase [EC:2.4.1.123] |
|
KO00380 Tryptophan metabolism |
|||||
|
c158051.graph_c0 |
65.61 |
518.17 |
9.01E-22 |
3.37 |
Acetyl-CoA C-acetyltransferase [EC:2.3.1.9] |
|
c159261.graph_c0 |
9.82 |
2.09 |
0.000740771 |
-2.13 |
Aldehyde dehydrogenase (NAD+) [EC:1.2.1.3] |
|
c147953.graph_c0 |
1.05 |
0.10 |
0.004897911 |
-2.94 |
Catalase [EC:1.11.1.6] |
|
c155633.graph_c1 |
6.82 |
0.52 |
1.80E-06 |
-3.20 |
Aldehyde dehydrogenase (NAD+) [EC:1.2.1.3] |
|
c142319.graph_c0 |
0.63 |
0.01 |
0.002402743 |
-5.22 |
Aldehyde dehydrogenase (NAD+) [EC:1.2.1.3] |
|
c100373.graph_c0 |
2.44 |
0.03 |
6.06E-06 |
-5.28 |
Catalase [EC:1.11.1.6] |
|
c157132.graph_c0 |
1.49 |
0.02 |
0.003419096 |
-5.51 |
Catalase [EC:1.11.1.6] |
|
c144783.graph_c0 |
0.90 |
0.00 |
0.002215283 |
↓ |
Catalase [EC:1.11.1.6] |
|
KO00903 Limonene and pinene degradation |
|||||
|
c159261.graph_c0 |
9.82 |
2.09 |
0.000740771 |
-2.13 |
Aldehyde dehydrogenase (NAD+) [EC:1.2.1.3] |
|
c155633.graph_c1 |
6.82 |
0.52 |
1.80E-06 |
-3.20 |
Aldehyde dehydrogenase (NAD+) [EC:1.2.1.3] |
|
c142319.graph_c0 |
0.63 |
0.01 |
0.002402743 |
-5.22 |
Aldehyde dehydrogenase (NAD+) [EC:1.2.1.3] |
|
KO01220 Degradation of aromatic compounds |
|||||
|
c137142.graph_c0 |
2.00 |
0.16 |
0.001651475 |
-3.33 |
S- (hydroxymethyl) glutathione dehydrogenase / alcohol dehydrogenase [EC:1.1.1.284 1.1.1.1] |
|
c123409.graph_c0 |
0.60 |
0.01 |
0.004049057 |
-5.10 |
Trans-cinnamate 4-monooxygenase [EC:1.14.13.11] |
|
c116282.graph_c0 |
0.93 |
0.00 |
0.000335956 |
↓ |
S- (hydroxymethyl) glutathione dehydrogenase / alcohol dehydrogenase [EC:1.1.1.284 1.1.1.1] |
FPKM，每100万个映射上的读长中映射到外显子的每一千个碱基上的片段个数，代表转录水平（n = 3）；A-NA，实验II和III中的0天样本；F-NA，于2015年10月26日在实验I中采样；FDR，错误发现率；FC，倍数变化；“↓”代表仅在A-NA表达的DEG（即F-NA中的FPKM为0）。
表2在实验I，II和III中注释为“早期光诱导蛋白”的差异表达基因。
|
# ID |
c122579.graph_c0 |
c165721.graph_c2 |
c161001.graph_c0 |
|
|
FPKM |
F-NA |
1.33 |
109.08 |
37.62 |
|
F-CA |
829.55 |
59742.56 |
10832.82 |
|
|
A-NA |
3.01 |
65.16 |
180.54 |
|
|
A-CA |
19.09 |
5681.80 |
850.92 |
|
|
A-CA+UVB |
73.58 |
6890.60 |
1688.36 |
|
|
log2FC |
F-NA versus F-CA |
9.33 |
9.12 |
8.33 |
|
A-NA versus A-CA |
2.80 |
6.46 |
2.41 |
|
|
A-NA versus A-NA+UVB |
5.27 |
6.96 |
3.79 |
|
|
Annotation |
Early light-induced protein 2 (Arabidopsis) |
Early light-induced protein 6 (R. catawbiense) |
Early light-induced protein 2 (Arabidopsis) |
FPKM，每100万个映射上的读长中映射到外显子的每一千个碱基上的片段个数，代表转录水平（n = 3）；F-NA，于2015年10月26日在实验I中采样；F-CA，于2016年1月20日在实验I中采样；A-NA，实验II和III中的0天样本；A-CA，实验II中的56天样本；A-CA + UVB，实验III中的56天样本。FDR，错误发现率；FC，倍数变化。
图3 A β-胡萝卜素向脱落酸（ABA）代谢的途径。B A途径中不同表达的基因（DEG）的热图。C 在野外（实验I）和人工（实验II和III）冷驯化期间叶片组织中ABA的变化。A中的红色，绿色，蓝色字体分别代表该途径中鉴定的上，下，上和下调的DEG。A中的黑色字体表示该特定酶中未鉴定出DEG。C中的小写字母表示实验I（空白条）或实验II（灰色条）中不同采样日期之间的显著差异（p <0.05）；C中的大写字母表示实验III中采样日期之间的显著差异（黑条）（p <0.05）。值为平均值±标准误差（n = 3）。F-NA，于2015年10月26日在实验I中采样；F-CA，于2016年1月20日在实验I中采样；A-NA，实验II和III中的0天样本；A-CA，实验II中的56天样本；A-CA + UVB，实验III中的56天样本（见图1A）。
图4 A α-亚麻酸代谢至茉莉酸（JA）生物合成的途径。JA生物合成的初始阶段发生在叶绿体中，其中关键酶脂氧合酶，丙二烯氧化物合成酶和丙二烯氧化环化酶位于其中。之后，将12-OPDA转移至过氧化物酶体，并通过3个β-氧化循环形成JA。B D路径中DEG的热图。C 在野外（实验I）和人工（实验II和III）冷驯化期间叶片组织中JA的变化。A中的红色，绿色，蓝色字体分别代表该途径中鉴定的上，下，上和下调的DEG。A中的黑色字体表示该特定酶中未鉴定出DEG。C中的小写字母表示实验I（空白条）或实验II（灰色条）中不同采样日期之间的显著差异（p <0.05）；C和F中的大写字母表示实验III中采样日期之间的显著差异（黑条）（p <0.05）。值为平均值±标准误差（n = 3）。F-NA，于2015年10月26日在实验I中采样；F-CA，于2016年1月20日在实验I中采样；A-NA，实验II和III中的0天样本；A-CA，实验II中的56天样本；A-CA + UVB，实验III中的56天样本（见图1A）。
4 在野外冷驯化中特异性富集的KEGG途径
4.1 KO00906“类胡萝卜素生物合成”途径
KO00906的“类胡萝卜素生物合成”途径在实验I中被特异性富集（图2C），并且该途径导致ABA的生物合成和分解代谢（图3A）。在该途径中，3个注释为“β-胡萝卜素3-羟化酶（CHY-β）”的DEG都被上调（图3B，表S1）。CHY-β将β-胡萝卜素转化为玉米黄质，在非光化学猝灭中的热耗散中起关键作用。1个注释为“玉米黄质环氧酶（ZEP）”的DEG被下调（图3B，表S1）。ZEP在叶黄素循环中将玉米黄质和/或花药黄质转化为紫黄质。因此，由于CHY-β的上调和ZEP的下调，玉米黄质可能在实验I中积累（图3B）。
有趣的是，有5个DEG被注释为“（+）-脱落酸8'-羟化酶（ABA8'ox）”。F-NA中相对较低转录水平的ABA8'ox1-3上调，而ABA8'ox4-5在野外冷驯化过程中受到抑制（图3B，表S1）。类胡萝卜素是ABA的前体，而ABA是ABA8'ox的底物（图3A）。ABA8'oxs随着内源性ABA水平的升高而上调。实验I中10月26日的ABA浓度是实验II和III中0天处理的3倍（图3C），并且实验I中1月20日的ABA水平降至实验II和III中的0天水平（图3C）。因此，ABA 8’ox1-3可能在野外冷驯化过程中参与ABA分解代谢，而ABA 8’ox4-5可能由于高水平的ABA而在非驯化条件下被诱导（图3C）。
实验II和III中的ABA变化与实验I中的变化不同——在实验II中，ABA含量从0天到56天增加了33％，而在实验III中，它从0天减少到7天，然后从7天增加到56天（图3C）。
4.2 KO00591“亚油酸代谢”和KO00592“α-亚麻酸”途径
在实验I中，分别有7和20个DEG富集到KO00591“亚油酸代谢”和KO00592“α-亚麻酸代谢”（表S1）。这些途径导致JA生物合成（图4A）。两个途径共享5个编码“脂氧合酶（LOX）”的DEG，并且被下调（表S1）。α-亚麻酸和亚油酸都是多不饱和脂肪酸（PUFA）和LOX的底物。KO00592“α-亚麻酸代谢”途径中20个DEG中的7个被上调（表S1）。其中有5个被注释为“12-氧-植物二烯酸还原酶（12-OPR3）”，并且转录水平非常低（表S1）。另一个注释为12-OPR3的DEG在实验I中被下调的F-NA中具有高转录水平（图4 B，表S1）。
实验I中，从10月26日到1月20日，JA含量大幅下降了93％，实验II中从0天到56天的JA含量下降了66％（图4C）。而在实验III中，JA在实验期间波动，并且没有表现出显著的变化（图4C）。在拟南芥中，AtLOX2和AtCYP74A（丙二烯氧化物合成酶，AOS）已被证明是JA生物合成的关键酶，而缺乏这两种酶均会抑制JA生物合成。而且，参与JA在烟草中积累的NaLOX3减弱。在这本研究中，13-LOX和AOS在实验I和II均被下调（图4B，表S1），表明抑制亚麻酸的消耗可能是在响应低温时保持膜的流动性。UVB被证明可以诱导拟南芥中JA的生物合成。因此，在实验III中，低温抑制JA生物合成，且UVB处理诱导或许可导致稳定的JA含量（图4C）。尚无关于UVB诱导JA生物合成中酶的报道，但本研究的数据表明AOS1上调（图4B）。
4.3 KO00195“光合作用”，KO00196“光合作用-天线蛋白”和KO04146“过氧化物酶”途径
KO00195“光合作用”，KO00196“光合作用-天线蛋白”和KO04146“过氧化物酶”途径在实验I中被特异性富集（图2C），它们与光保护有关。
在KO00196的“光合作用-天线蛋白“途径中，DEG被标注为“光捕获复合物”，而9个DEG中有4个被下调（表S1，图S4）。这四个下调DEG的转录水平（即FPKM值）高于F-NA中的其他DEG（表S1），表明这4个独立基因在植物中起关键作用，而叶组织试图通过减少冬季的光捕获复合物来降低光能的吸收。
在实验I中，从10月26日到1月20日，叶绿素（a + b）含量下降了30％（图5A），在实验II和III中从第0天到56天，叶绿素含量分别下降了23％和15％（图5B）。这些表明叶片试图通过降低温度降低叶绿素含量来降低光吸收。叶绿素a/b代表反应中心和核心天线蛋白相对于光捕获蛋白的化学计量变化，在实验I中从10月26日到1月20日下降了15％（图5C），并在从实验2和实验3的0天到56天处理分别降低了8％和6％（图5D）。叶绿素a/b的变化表明，实验I中反应中心的降解比实验II和III中的严重。代表光系统II反应中心开放性的光化学猝灭（qP）在实验I中从10月26日到1月20日降低了57％（图5E），在实验II和III中，从0天到56天的处理分别降低了43％和25％（图5F）。在实验I中，叶绿素（a + b），叶绿素a/b和qP的减少越多，表明光保护和/或光抑制作用越明显。
在KO00195“光合作用”途径中，DEG被注释为负责电子运输，光系统I或II的亚基和ATPase等活性的蛋白质（表S1；图S5）。在KO04146“过氧化物酶”途径中，被注释为酶抗氧化剂“超氧化物歧化酶”和“过氧化氢酶”的8个DEG被上调（表S1）。这两个途径中大多数DEG的转录水平都较低（表S1）。
此外，除了富集到KEGG途径的DEG外，表2中还显示了三种编码功能蛋白“早期光诱导蛋白（ELIP）”的DEG。已经发现ELIP是实验I中诱导程度最高的基因之一，并且实验I中的上调程度大于实验II和III中的上调程度（表2）。还发现ELIPs在CA拟南芥叶片，蓝莓芽和酒红杜鹃叶片中是主要的上调基因。ELIP位于类囊体膜中，它们结合叶绿素a并在光保护中起重要作用。它们的积累可以由多种生理条件触发，包括光胁迫和低温，并且与光系统II反应中心的降解有关。实验I中ELIP的大量上调表明在野外CA期间光保护和/或光抑制更为明显。
图5野外（实验I，A，C，E）和人工（实验II和III，B，D，F）冷驯化期间的叶绿素（a + b）（A，B），叶绿素a/b（C，D）和光化学猝灭（qP，E，F）的变化。在实验I中，A，C和E中的小写字母表示不同采样日期之间的显著差异（p <0.05）；B，D和F中灰色条上方的小写字母表示实验II中不同采样日期之间的显著差异（p <0.05）；B，D和F中黑条上方的大写字母表示实验III中不同采样日期之间的显著差异（p <0.05）。值为平均值±标准误差（A，B，C和D中n = 3；E，F中n = 7-9）。
5 KEGG途径通常在野外和人工冷驯化中都被富集
5.1 碳水化合物代谢
属于碳水化合物代谢的5个KEGG途径通常在实验I，II和III中被富集（图2C，图6A）。
在KO00053“抗坏血酸代谢”，KO01200的“碳代谢”和KO00630的“乙醛酸和二羧酸代谢”途径中，大多数DEG在实验I中被上调，而在实验II和III中被下调（图6A）。在KO00040“戊糖和葡糖醛酸酯的相互转化”中，实验I上调了23个DEG中的10个，而实验II和III中上调了17个DEG中的2个和25个DEG中的3个（图6A）。在KO00500“淀粉和蔗糖代谢”中，实验I，II和III中32个中的14个，21个中的9个和33个中的10个被上调（图6A）。KO01200“碳代谢”图显示，戊糖磷酸途径中的所有DEG和糖酵解中的大多数DEG在实验I中均被上调，但在实验II和III中均被下调（图S6）。这些数据表明实验I中碳水化合物代谢的变化不同于实验II和III，这可以通过糖量的变化来证明（图6B）。
在实验I中，从10月26日至1月20日，叶片葡萄糖和果糖浓度分别增加了10倍和7倍（图6B）。然而，在实验II和III中，从0天至56天的处理，葡萄糖和果糖仅分别增加了约1.6倍和2.7倍（图6B）。在实验I中，从10月26日至1月20日，叶蔗糖浓度增加了1.3倍，在实验II和III中，从0天至56天的处理中叶蔗糖浓度分别增加了1.2倍和1.3倍（图6B）。这些结果表明葡萄糖和果糖比蔗糖对FT更为重要，在拟南芥中也观察到了相似的结果。
图6 A“碳水化合物代谢”的KEGG途径（p <0.05）在实验I（白色背景），II（浅灰色背景）和III（深灰色背景）中被普遍富集。显示了每个KEGG途径中差异表达基因的数量。B 在野外（实验I）和人工（实验II和III）冷驯化期间，叶片葡萄糖，果糖和蔗糖浓度的变化。C和D 分别表示KO00941“类黄酮生物合成”和KO04712“昼夜节律－植物”途径中差异表达基因的热图。B中空白条和灰色条上方的的小写字母分别表示实验I和II中不同采样日期之间的显著差异（p <0.05）；B中黑条上方的大写字母表示实验III中不同采样日期之间存在显著差异（p <0.05）。值为平均值±标准误差（n = 3）。F-NA，于2015年10月26日在实验I中采样；F-CA，于2016年1月20日在实验I中采样；A-NA，实验II和III中的0天样本；A-CA，实验II中的56天样本；A-CA + UVB，实验III中的56天样本（见图1A）。
5.2 花青素的生物合成
实验I，II和III中分别有8、8和11个DEG富集到KO00941“类黄酮生物合成”（表S2）。这些DEG也参与花青素的生物合成。实验I中的八个DEG均被上调；实验II和III中的1和3个DEG分别被下调（表S2）。这些DEG的转录水平显示在图6C中。除了FLS1，HCT和CHS4之外，F-NA和A-NA中其他DEG的FPKM均低于冷驯化样品（即F-CA，A-CA和A-CA + UVB）的FPKM（图6C，表S2）。尽管A-CA中没有明显的花青素积聚（图1E，图S3），但A-CA中的C4H，FLS2，DFR，ANS，F3H，ANR，CHS1，CHS2，CHS3的转录水平（图6C，表S2）高于花青素积累的A-CA + UVB或F-CA（图1E；图S3），表明低温可能诱导花青素生物合成相关基因的表达，而花青素的生物合成可能是转录后加工。
花青素在细胞质中合成，然后通过谷胱甘肽S-转移酶（GST）转移到液泡中，谷胱甘肽S-转移酶催化花青素（氰化-3-葡萄糖苷）与谷胱甘肽结合。在本研究中，KO00480的“谷胱甘肽代谢”途径被富集到实验I和III中的花青素积累（图1E；图2C；图S3）。在实验I和III中，分别将18个DEG中的12个和19个DEG中的13个注释为“GST”（表S3）。其中，在实验I和III中分别上调了12和8个GST（表S3），这表明在合成花青素后，谷胱甘肽的代谢途径很重要。
5.3 KO04712“昼夜节律植物”
实验I，II和III中分别有8、6和8个DEG富集到KO04712“昼夜节律植物”（表S2）。除了实验III中的1个DEG被下调外，其他DEG被上调（表S2）。在实验I中特异发现了三个DEG，分别编码“E3泛素蛋白连接酶COP1-like（COP1）”，“LONG HYPOCOTYL 5（HY5）”和“晚期伸长下胚轴（LHY）”（图6D；表S2）。COP1在F-NA和A-NA中显示出不同的初始转录水平，并且在实验I，II和III中上调（图6D）。E3泛素蛋白连接酶COP1在转录后影响HY5表达。HY5是碱性亮氨酸拉链（bZIP）家族和多个光感受器下游的转录因子。该基因在光照和/或低温下受转录影响，据报道与拟南芥中CA的完全形成有关。在实验I中，HY5大量增加，而在实验II和III中，在4°C处理后，HY5并未表现出显著变化（图6D，表S2），这表明“Elsie Lee”对HY5的调控可能比以前的报告更为复杂。LHY是MYB相关的转录因子，被归类为昼夜节律的早晨基因。在本研究中，F-NA和A-NA中LHY的初始表达水平显著不同（图6D）。并且它在实验I中上调，但在实验II和III中下调不显著（图6D）。其他DEG注释为“伪响应调节剂（PRR）/类两组分响应调节剂”或与冷相关的“查耳酮合酶（CHS）”，在实验I，II和III中普遍发现（图6D；表S2）。在生物钟中，PRR和LHY一起被称为“早晨基因”，LHY的表达是为了增强PRR的表达。实验II中昼夜节律途径的DEG表明，低温本身干扰了植物昼夜节律。
6 使用qPCR验证RNA-seq数据
为了验证RNAseq数据的准确性，选择了参与光保护，花青素积累，昼夜节律和α-亚麻酸/亚油酸降解等活动的14个DEG并通过qPCR进行了验证。qPCR中每个DEG的上调或下调与RNAseq分析的结果一致（图S7）。
图7总体研究的示意图。A “Elsie Lee”（实验I）中的野外冷驯化（CA）模型。ABA，脱落酸；JA，茉莉酸；FT，耐冻性；RCII，光系统II反应中心。B “Elsie Lee”（实验II和III）中的人工CA模型。LD，长光照周期。绿色实心三角形表示浓度降低。红色实心三角形表示浓度增加。除了蔗糖，实验I的变化程度要强于实验II和III。B中蓝色框中的参数表示实验II和III之间的变化是不同的。
讨论
1 对光保护的要求可能决定了冬季越冬常绿植物叶片中ABA水平的降低
研究人员观察到，在各种类型的胁迫下，例如寒冷，组织ABA的水平会升高，并且ABA参与了信号传导途径。已有研究报道，在CA期间，圆锥绣球的木质部汁液中的ABA浓度增加。外源ABA处理可以增加芽的耐冻性。ABA缺陷的拟南芥突变体在CA期间丧失了增加FT的能力。但是，与这些相反，本研究发现在实验I中，ABA水平随着FT的增加而逐渐降低（图1D，图3C）。在本研究中，F-NA的ABA水平比A-NA高约2倍，这表明ABA在10月26日之前增加了。一旦发生低温，ABA的增加可能会导致组织停止生长，进入CA状态，并尽快增加LFT。由于自然条件的复杂性，ABA的增加可能是对光周期，光照强度和/或光质的响应。在秋季，在较短的光周期下，桦木，杨树或野外生长的树木的芽和木质部汁液中的ABA瞬时增加。已有研究证明，日长是ABA浓度和转录因子PtABI3表达以及杨树芽形成和休眠的重要组分。在实验现场，最长的光周期发生在7月20日前后，约为14 h，而当10月26日（图S2）在实验I中收集到第一个样品时，则缩短至11.2 h（图S2）。以前研究报道，与在150 µmol m-2 s-1或60 µmol m-2 s-1下的叶片相比比，高光胁迫（750 ± 50 μmol m-2 s-1或1200 μmol m-2 s-1）诱导拟南芥叶片ABA的积累。自然光强度（数据S1）比实验II和III中的室内光强度（90 µmol m-2 s-1）高得多。此外，在从暖季到冷季的过渡期间，由于暮光持续时间的增加，红光与远红光的比率降低。事实证明，远红光可以提高拟南芥种子和番茄叶片中的ABA水平。因此，作者推测通过响应自然光信号，叶片ABA在早秋增加，但是在本研究中无法获得诱导ABA积累的确切因素。
随着冬季发生低温（图1B），ABA水平下降（图3C）。ABA的生物合成是玉米黄质到ABA的下游步骤（图3A）。环氧类胡萝卜素（紫黄质和新黄质）的缺乏导致在拟南芥和灰叶烟草中ABA生物合成的缺乏。以前的研究报道，越冬常绿植物叶片（包括冬天的红叶）会积聚大量的花药黄质和玉米黄质，以在冬季长期散热。在本研究的数据中，CHY-βs的上调和ZEP的下调表明在野外CA期间玉米黄质的积累（图3B）。因此，当“Elsie Lee”对低温之前自然光条件的变化做出响应时，类胡萝卜素可能主要分配给ABA的积累。发生低温后，玉米黄质主要用于光保护。另外，为了平衡叶片组织中的ABA水平，下游的ABA8'oxs被上调以分解代谢ABA（图3B）。因此，除了高库源外，没有其他来源导致冬季ABA下降。
在实验II中，增加的ABA（图3C）可能是对低温的响应，这表明ABA信号转导在低温发生时开始。因此，低温可以代替光信号以在常绿植物中诱导ABA的信号转导。此外，由于对玉米黄质的需求较弱（图3B），玉米黄质可能主要分配给ABA生物合成。ABA持续增加直至第56天处理，但实验II中ABA8'ox没有显著上调（图3B，C）。因此，是否存在ABA水平的阈值来激活常绿乔木在冷胁迫下的转录需要在进一步的研究中探索。实验一和实验二中ABA的不利变化表明，多种机制共存于植物中，选择哪种机制取决于不同的情况。以前的研究观察到UVB处理玉米和拟南芥中后ABA含量增加。在实验III中，低温和UVB胁迫共同作用下的植物在7天处理中显示出ABA减少，而从7天处理至56天处理则显示出增加（图3C），这可能是由于多种胁迫的结合，但其背后的机制需要进一步研究。
2 CA中涉及PUFA累积和JA降解的串联
α-亚麻酸和亚油酸是PUFA和LOX的常见底物。PUFA可以维持膜的流动性，并且据报道在冷胁迫期间会积累。先前的研究表明，寒冷会迅速诱导JA积累，而JA参与CBF途径以增加FT或诱导相对蛋白积累（脱水蛋白）。除低温外，红光与远红光比例，ABA的降低和胞浆Ca2+的增加均可诱导JA的生物合成。尽管我们无法验证哪个因素诱导了F-NA中JA的积累，10月26日至1月20日ABA和JA含量的相似趋势（图3C，图4C）表明，在野外冷驯化期间ABA和JA之间可能存在协同作用。然而，据报道在防御和抗病基因的表达方面，水稻根部和拟南芥中也有ABA和JA的拮抗作用。在长时间的光周期下，实验II中的ABA和JA浓度显示出相反的变化（图3C，图4C），这表明野外和人工CA之间的机理不同。
在实验II和III中，观察到在4°C处理期间JA值没有增加（图4C）。造成这种情况的可能原因可能是因为JA的增加是短暂的，并且7天的采样间隔未检测到JA的增加。
3 光合作用和呼吸作用决定了碳水化合物的代谢，从而影响了耐冻性的提高
在冬季，光合作用通常会受到抑制，但是常绿植物的叶片会吸收光能，因为该过程与温度无关，这种情况可能会导致光抑制（即暂时或持续的光保护形式，导致光合作用受到抑制）。在实验I中，叶绿素a/b和qP比实验II和III显著降低（图5C，D，E，F）表明光合活性降低得更多；因此，光保护作用更强，正如花青素积累（图1E），叶绿素降解（图5A，B）和玉米黄质积累（正如DEG上调所指示）（图3B）所表现的那样，这表明野外的光胁迫较严重（数据S1）。以前的研究表明，较低的Fv/Fm（光抑制指标）与较高的FT相关。本研究表明在不造成伤害的范围内，CA期间高光强度的胁迫将导致较大的FT。
光合作用和呼吸对温度敏感并且相互依赖。呼吸作用依赖于光合作用的产物，而光合作用依赖于呼吸作用的化合物。另外，呼吸作用是光合产物的主要库，继而影响光合能力。人们普遍认为，冬季呼吸频率降低以积累碳水化合物，碳水化合物被认为是细胞渗透剂或防冻剂。但是，这本研究中的KO01200“碳代谢”图谱表明，在实验I中上调了戊糖磷酸途径和糖酵解这两个呼吸过程中的大多数DEG，在实验II和III中下调（图S6），这表明在野外和人工冷驯化过程中，会出现呼吸的不同变化。研究人员观察到，EST参与越冬植物酒红杜鹃野外CA期间的糖酵解。以前研究报道，在环境温度下“snow gum”叶子的早晨呼吸速率在冬天比夏天还要强。研究人员对15种木本植物的呼吸反应进行了调查，发现15种木本中有13种的茎在接近冰点温度对的呼吸作用显著提高。一些研究人员认为，呼吸提供的能量（即ATP）可以帮助修复因光抑制而降解的蛋白质（例如D1），并在整个叶黄素循环中维持整个类囊体膜的质子梯度。此外，呼吸作用对于叶黄素所需的抗坏血酸产生也至关重要。
呼吸/光合作用对于碳水化合物的代谢很重要，该比率可能受环境因素的影响，如温度，光和CO2浓度。作者认为，从秋季到冬季野外环境因子的复杂变化会导致呼吸速率和光合速率的变化，从而导致呼吸和光合作用比率的变化，进而导致野外CA期间积累更多的葡萄糖和果糖。葡萄糖和果糖在“Elsie Lee”中对LFT的作用比蔗糖更为重要，以前在拟南芥属研究中也观察到。
4 常绿植物中花青素的生物合成主要与光保护有关
为了独立研究花青素在增加FT中的作用，设计了实验III，因为UVB可以诱导花青素的生物合成。在这项研究中，当实验III的叶绿素（a + b）和qP高于实验II时（图5B，F），在CA第56天后，实验III中的花青素比实验II中高约6倍（图1E），表明花青素含量较高的叶片叶绿素降解程度相对较低，而PSII反应中心则关闭/降解。然而，尽管在实验II中花色苷没有显着增加（图1E，图S3），但是低温诱导了花青素相关基因的转录表达（图6C），表明花青素相关基因在CA网络中。由于实验II和III中CA处理56天后LFT没有显著差异（图1D），作者推断越冬植物叶片在CA期间，与FT增加相比，花青素的作用与光保护作用更相关。
5 昼夜节律对于CA的完全形成至关重要
植物通过整合昼夜循环中环境条件（光照和温度）的变化，使内源节律（生理和新陈代谢）与环境节奏同步。由于许多基因在一天的明暗循环中对光有响应并表现出规律的变化，因此光周期是影响昼夜节律的因素之一。
研究人员已经证明，生物钟是诱导与寒冷相关的基因（例如CBF）的阀门。本研究表明，昼夜节律途径对CA很重要，该途径在每个两对对照中被富集（图2C，表S2）。在多年生木本植物中，冬季条件（短暂的光照和低温）破坏了栗木中LHY的日常振荡表达，从而导致其在冬季的高表达。本研究，在实验I中，编码LHY的DEG在CA期间表现出强烈的上调（图6D；表S2），表明LHY在完整的CA中发挥作用。HY5转录调控大量基因，这使它成为转录网络中心的枢纽。它通过诱导拟南芥中所有冷诱导基因的10％来作为CA的正调节剂。已有研究报道，HY5的上调通过整合低温和光信号传导，确保拟南芥中CA的完全形成。具有较高SlHY5表达的番茄叶片表现出增强的FT。此外，研究表明SlHY5直接结合至SlNCED6（ABA生物合成酶）的启动子，并诱导ABA生物合成。在本研究中，具有较高FT的叶片具有编码HY5的DEG，其表达增加了约3.4倍（图6D；表S2）。而HY5的表达与ABA的积累没有相关性（图S8），这可能是草本植物和多年生木本植物之间鉴定出的差异之一。
结论
本研究进行了三个实验，以表征越冬常绿植物叶片中的CA，并了解到低温之前的光信号对于进一步提高FT是必不可少的，因为某些信号转导途径的激活可能诱导生长停止和CA（图7）。随着低温的发生，发生光抑制和光保护，并且强光胁迫可以积极地增加越冬植物叶片的FT。玉米黄质的积累是一种光保护策略，作为ABA生物合成的上游，可能在ABA水平中发挥关键作用。在此报告中，观察到“Elsie Lee”中的ABA与营养生长的植物相比，可能在初秋通过对光信号的响应而积累，而在冬季到来时则下降。光信号和低温都扰乱了“Elsie Lee”的昼夜节律（图7），并且涉及转录因子HY5和LHY。此外，野外和人工CA的过程非常不同，包括激素信号转导，光抑制/光保护程度，脂肪酸代谢和呼吸作用，这导致完全或不完全CA后的FT有所不同。人工CA中的UVB处理表明，在常绿叶片CA期间，花青素与光保护的关系比增加FT的关系更大。
这项研究为全面认识越冬常绿植物中的CA提供了机会，并在木本植物CA领域提出了一些问题，例如，越冬的叶子如何整合光和低温信号以将玉米黄质分配给ABA代谢，以及呼吸如何响应低温，一方面缓解光抑制作用，另一方面累积碳水化合物。