综述 | 美国范德堡大学：利用单细胞组学技术对胃肠道疾病进行研究：从单细胞特征到病人特征
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Use of Single Cell -omic Technologies to Study the Gastrointestinal Tract and Diseases, From Single Cell Identities to Patient Features
译名：利用单细胞组学技术对胃肠道疾病进行研究，从单细胞特征到病人特征
期刊：Gastroenterology
IF：19.233
发表时间：2020.04
通讯作者：Ken S. Lau
通讯作者单位：美国范德堡大学医学院
DOI号：10.1053/j.gastro.2020.04.073.
主要内容
基于候选基因的方法
对单个细胞的分子特征进行分析对于临床研究来说并不新鲜。几十年来，病理学家一直在使用显微镜、免疫组织化学和原位杂交来识别人体组织中的细胞，如浸润的淋巴细胞。流式细胞术用于免疫和其他疾病患者的血细胞免疫表型分析。这些技术被称为基于候选基因的方法，因为它们需要探针来检测特定的分子。
研究进展主要受到荧光光谱重叠的限制，为了在单细胞水平上实现多重分析，机器就可以代替人类专家从多重测量中识别细胞。实现多重的方法主要有两种。首先，抗体的元素同位素标记使质谱探针的溢出最小。流式细胞术结合金属抗体标记（CyTOF）和显微镜检测能够以单细胞分辨率分析30-40个目标。
通过对流式细胞术进行优化，研究肠上皮内的信号传导和固有层中的免疫细胞。例如，Chuang等人用CyTOF研究了克罗恩病患者固有层中的免疫细胞浸润，他们发现CSF2RB中携带移码突变的单核细胞对粒细胞-巨噬细胞刺激因子的反应减弱。Martin等人还使用CyTOF鉴定克罗恩病患者回肠组织中的独特成纤维细胞和免疫细胞，这些细胞有助于抵抗肿瘤坏死因子拮抗剂。
迭代方案可以与显微镜一起使用，这样即使使用相同的检测标签，不同的探针也可以应用于不同的成像过程。利用先进的配准方法，产生了类似于标准3或4通道荧光图像的多通道图像。迭代方案可用于检测蛋白质或转录本，这些方案之间的差异影响迭代时间。Gerdes等人在包含747个大肠癌（CRC）患者样本的组织微阵列中对61个蛋白质抗原进行了染色，他们发现肿瘤之间存在着广泛的异质性，这些异质性对应于特定的信号通路。使用多重蛋白质成像，Ligorio等人发现肿瘤相关成纤维细胞有助于胰腺肿瘤内部的异质性。多维图像的算法可以分割产生类似于大规模细胞术或基于像素的的单细胞分辨率数据。这些研究背后的主题围绕着与疾病过程相关的新的细胞群的发现。通过多个探针标记组织，可以检测多种细胞类型，并组合标记来定义意外的细胞类型或状态。因此，该实验可以筛选与表型相关的新的细胞群，实现了与单靶点方法（如免疫组织化学）不同的目标，免疫组织化学只能检测单细胞群的单个标记。
基于候选基因的方法由于与传统病理分析一致，最适合用于人类研究，并且已经探索了对大量组织学图像的机器学习。然而，基于候选基因的方法需要精确的探针，并且由于缺乏对照样品，确定探针（如抗体）在人体组织中检测的特异性和敏感性是一个挑战。此外，对预选标记物的测量对导致疾病发展的因素新见解只提供了一个狭窄的范围。
细胞悬液中转录组的单细胞分析
非目标测序不依赖于候选基因探针的质量，因为测序数据本质上大多是分类的。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是研究细胞异质性的最成熟的单细胞基因组学之一。自2016年以来，基于液滴的技术的出现，使得能够对数千个细胞而不是数百个细胞进行高通量分析，使用scRNA-seq分析的研究大幅增加。实验方案提供了不同方面的转录组信息，例如来自全长分析的异构体信息和基于3’poly（A）捕获转录本的差异基因表达。
单细胞RNA测序包括将单个细胞分离、封闭并构建核酸文库进行测序。一个重要的预分析在于组织收集和处理。缺血条件和单个细胞的分离可以将重要的人工误差引入细胞转录组。从外科或活检样本中采集的新鲜样本，立即处理可以产生最高质量的数据。单细胞通过胰蛋白酶或胶原酶等酶而分离，然后进行机械研磨。新鲜组织处理的优化，如冷蛋白酶分离，使单细胞分离过程中的干扰最小化。对于分离具有挑战性的组织类型或无法控制缺血时间的情况，组织可以快速冷冻，因此，可以保留核酸的质量，并分离出单个细胞核进行单核（sn）RNAseq。snRNA-seq的优点是可以对收集的冷冻存档样本进行修改，但应注意的是，与整个细胞相比，细胞核所含的物质更少，在转录组中的表达有显著差异。无论采用何种方案，在组织制备过程中，由于选择性过滤和回收，可能会人为地改变特定细胞类型的相对丰度。
表1 单细胞基因组的细胞捕获和条形码方法
从平板到微滴有多种方法，可以包含单个细胞，从而可以制备单个细胞的cDNA文库（表1）。技术上最可行是基于液滴或基于纳米井的方法，这些都是高通量方法，并且由于条形码（图1）、小型化和自动化，需要较少的人工手动操作。尽管下游的文库制备存在细微差别，导致不同的覆盖范围，但由于起始的量较低，所有的scRNA-seq文库都需要扩增。少量的RNA中，特别是对于不太丰富的转录本，会产生技术噪声。研究人员应平衡使用指数扩增（如PCR）和线性扩增（如体外转录）的成本效益。指数扩增很容易，需要的技术技能较少，但导致高度丰富的转录本偏差放大，需要更多的排序来克服。线性扩增允许低丰度转录本检测，但很耗时，需要多个步骤的处理RNA。Ziegenhain等人和Wang等人对不同的scRNA-seq方法进行了比较分析，这些方法可以为选择特定的方法提供信息。
图1 单细胞高通量基因组分析的条形码方案
序列数据的下游处理和分析有多种选择。FASTQ数据的映射可以通过多种映射算法实现，包括TopHat、STAR和Kallisto Bustools。Seurat或Scanpy等流行的数据分析包可用于下游分析。这些软件工具可以将多维数据的降维以达到可视化，例如t-SNE和UMAP。
这些工具可以对具有类似表达图谱的细胞进行分组，从而能够识别和分析细胞类型和状态。然而，由于转录组的不完全取样，一个重大的挑战是单细胞水平数据的质量。这些噪声数据需要额外关注，质控低质量细胞以及不相关的基因特性。值得注意的是，在人类研究中，scRNA-seq的应用是从大量患者中获取和分析数据集（图2）。研究人员开发了可以比较整个单细胞图谱的工具，用于发现样本和患者的亚型。
图2 单细胞组学技术的潜在临床应用
基于切片的空间转录组分析
转录组学分析通常在失去空间背景的单细胞悬液中进行。通过短距离和长距离的信号机制，以及它们作为环境功能（如缺氧或正常氧）的特性和行为，细胞的位置决定了它们与其他细胞的相互作用。此外，组织中的细胞，特别是疾病患者的细胞，在空间上是异质的。例如，克罗恩病的肠道组织含有病理性跳跃性病变，这些病变散布在正常组织的区域中。基于悬浮液的scRNA-seq产生健康组织和受影响组织的混合的数据，混合着疾病特异性信号。原位分析不需要分离或单细胞提取，因此保存了原生组织细胞类型的准确表达。为了在空间分辨率分析，研究人员使用基于候选基因的方法对目标进行分析。为了将这些方法扩展到基因组水平，seqFISH+和MERFISH使用校正的时间荧光条形码将测量到的mRNA数量扩展到10000。为了使时间条形码工作，必须分解mRNA的单个分子，这限制了组织的体积。因此，这些方法最适合用高端显微镜进行高、亚细胞分辨率成像，而这些显微镜在研究环境之外并不总是可以使用的。因此，最近的研究将seqFISH+与延伸显微镜结合起来，在更深的细胞器水平上观察基因表达。
在光谱的另一端，当不需要单细胞分辨率时可以获得基因组的数据。例如，激光捕获显微切割可以以低通量的方式使用，即使使用固定的样本，也可以对少数到几十个细胞的转录本进行分析。对于低分辨率组织分析，多个研究组已经开发出涉及空间条形码代替单细胞条形码的技术。通常，这些方法将寡核苷酸条形码或寡核苷酸结合珠固定在载玻片上，然后组织进行切片并渗透，使寡核苷酸捕获mRNA。然后以类似于scRNA-seq的方式将寡糖释放、汇集并制备为文库。捕获过程中整合到cDNA中的空间条形码可以映射回组织切片中的原始位置。
这些方法结合了用于组织结构分析和全局转录组分析的空间信息，用来描述免疫治疗期间免疫细胞向肿瘤的浸润。这些方法的分辨率约为50-100微米，因此每个条形码包含几十个细胞的信息数量。目前正在开发分辨率低于10微米的改进方案，尽管就检测到的转录本数量而言，数据质量受到影响。然而，基于切片的数字病理学和scRNA-seq已经变得更为普遍，因此，这些组合方法可以快速推进对患者组织的分析。
单细胞转录组分析在胃肠病学中的应用
scRNA-seq可以用来评价组织的异质性，而在胃肠道和肝脏中负责特定功能或疾病的细胞类型是scRNA-seq的直接应用。在基础科学的背景下，scRNA-seq已经被用于在肠道上皮细胞中发现新的内分泌细胞和细胞簇，以及免疫细胞和基质细胞。因为scRNA-seq是一种终点分析方法，观察结果来自于收集组织时的状态，它可以应用于从模式生物到人类病人等一系列标本。scRNA-seq是下一步走向精确医学的基础，类似于TGCA和CPTAC等。目前正在组建大型的国家和国际联合组织，利用scRNA-seq对大量健康和患病组织进行鉴定。
scRNA-seq的一个主要应用是在癌症生物学中，肿瘤内和肿瘤间的异质性是合理设计治疗方案的一个主要挑战。我们对癌症表型和亚型的描述主要依赖于批量测序或蛋白质组分析，这些分析掩盖了潜在的重要细胞群，例如那些可转移的，而scRNA-seq可以消除细胞异质性。此外，利用scRNA-seq对肿瘤图谱进行全面的表征，包括在微环境中的免疫和成纤维细胞浸润，可用于描述不同的疾病亚型和患者预后。最近的一些研究表明，在消化系统癌前病变和癌症中成功地应用了scRNA-seq，系统地分析了癌细胞基因型、表型和微环境。Zhang等人发现了大肠癌中T细胞的动态关系，并鉴定了大肠癌细胞亚群。Bian等人使用多组学方法解剖了10个大肠癌，为理解原发性大肠癌发生的分子特性提供了基本的见解。另一项研究使用scRNA-seq检测了不同胃癌亚型的转录动力学，他们将OR51E1作为胃癌早期恶性病变中内分泌细胞独特的标记物。Owen等人研究了食管癌，利用scRNA-seq发现Barrett食管和正常食道之间的转录相似性。最近的肝细胞图谱确定了肝的细胞组成，并揭示了肝细胞癌发生的表型变化。Zheng等人利用scRNA-seq发现了肝癌中具有不同功能的浸润性T细胞，这为了解肝癌的免疫状况和预后潜力提供了有价值的见解。scRNA-seq可以通过深入描述免疫微环境来预测患者的反应，从而为免疫治疗作出贡献。
炎症性肠病的特征是肠道的慢性炎症。情况较复杂，如IBD，其中细胞生态系统的变化与疾病表型相关，可以用scRNA-seq来解析。Parikh等人对IBD和正常结肠进行了比较研究，以确定IBD的特定细胞类型。他们发现OTOP2表达的结肠吸收细胞在IBD和癌症中经常失调。利用scRNA-seq，他们还分析了细胞对结肠炎症的特异性反应，发现WFDC2的分泌是粘液屏障完整性所必需的。scRNA-seq还用于描述克罗恩病患者对肿瘤坏死因子拮抗剂耐药的IgG血浆细胞、炎性单核吞噬细胞、活化T细胞和基质细胞的网络。Smillie等人生成了溃疡性结肠炎的单细胞图谱，精确地将GWAS风险映射到细胞IBD中。Kinchen等人对结肠间充质细胞进行了单细胞分析，揭示了炎症和屏障功能障碍相关的非预期异质性和间充质重塑。单细胞分析可以用于研究微环境沟通机制，提高对复杂胃肠道疾病的认识。
虽然临床决策还不能基于scRNA-seq数据，但它们可以用于确定患者的预后和疾病亚型。scRNA-seq数据也可以作为参考，从现有的普通RNA-seq数据中解析细胞成分，例如使用MuSiC、xCell和CIBERSORTx等算法。尽管单细胞转录组分析方法具有广阔的应用前景，但仍存在一些局限性，阻碍了它们在临床上的应用。转录组分析中仍有许多地方可以引入人为误差，降低再现性，计算专业知识需求相当高。对于临床决策而言，解释结果所需的成本和效率高得令人无法接受。最后，对于获得新鲜组织可以生成最佳质量的scRNA-seq数据，这对许多诊所来说是一个挑战。所有这些都是不利因素，但许多团体正朝着解决这些问题的方向前进。
单细胞表观遗传学分析
表观遗传信息将基因组连接到转录组。用于测定单细胞转录本的微流控模式已扩展用于单细胞表观基因组的研究。这些技术可以研究单个细胞中染色质可及性、蛋白质-DNA相互作用、染色体构象和DNA甲基化。
利用测序（scATAC-seq）靶向基因组区域对染色质可及性进行单细胞分析。这些捕获的基因组序列可以是顺式作用的DNA元件，可以通过转录因子进行转录或调控。利用单细胞转录组学的微流控平台，建立了几种scATAC-seq方法，每个细胞核产生一个单一的条形码的基因组片段库，可富集基因组位点区域。
单细胞染色质构象捕获方法可用于鉴定顺式作用的DNA元件，并确定它们对潜在调控因子的物理近邻距离。最近，在单细胞分辨率下，拓扑相关结构域和由环结构介导的长染色质相互作用可以用3C方法检测。Hi-C及其在单细胞中的应用，如sc-Hi-C和sci-Hi-C，由Nagano等人和Ramani等人开发，结合染色质交联、限制性酶消化和近端连接酶，创建捕获空间上近端DNA片段的文库。sci-Hi-C在微孔中分离细胞核并结合条形码。这些方法使每个细胞有一个单一的文库，包含代表邻近基因组位点的片段。尽管这并不是一种精确的单细胞染色质构象捕获方法，但由Chen等人开发的一种ATAC-See的ATAC-seq的改良方法允许用可见荧光团共价标记可染色质。这可以通过显微镜和随后的高通量测序进行可视化。
单细胞染色质免疫沉淀法靶向单个分离细胞内的蛋白质-DNA相互作用。这些方法依赖于特定的抗体-蛋白质相互作用。Drop ChIP是Rotem等人开发的一种方法，它从液滴分离的单个细胞中提取与蛋白质相关的基因组片段，并用独特的DNA条形码标记它们。这些含有单个细胞内容物的纳升液滴被破碎并聚集，用于免疫沉淀和文库生成。这些信息也可以通过Kaya Okur等人开发的CUT&Tag方法获得。该方法利用蛋白质结合的Tn5转座子将这些元素定位到蛋白结合抗体中。靶向定位的转座子使基因组片段化。这些反应适用于纳米孔的单细胞分离系统，因为抗体结合和转座子导入可以在分离前在整体水平上进行。这两种方法都产生测序文库，其中包含与抗体靶向蛋白相关联的顺式作用调控元件。
单细胞甲基化和羟甲基化（sc-5mc和sc-5hmc）检测基因组胞嘧啶残基的共价修饰。通常，这些修饰在CpG岛中富集，高浓度可导致基因表达沉默或可逆下调。这些方法根据其亚硫酸氢钠依赖性进行分类，将胞嘧啶残基转化为测序可检测的尿嘧啶。单细胞全基因组和简化表达测序方法依赖于亚硫酸氢盐的转化，已用于捕获基因组甲基化。相反，单细胞CpG岛甲基化测序结合甲基化敏感的限制性消化和多置换扩增来产生甲基化CpG岛富集相关基因座的测序文库，同时避免了破坏性的亚硫酸氢盐转化。
与单细胞转录组一样，单细胞的表观遗传数据也可用于人类研究，可用于确定患者的预后或选择治疗。Bormann等人检测了结直肠肿瘤组织中CpG岛甲基化表型和起源细胞特征，并确定了与患者生存相关的肿瘤表观遗传学亚型定义。其他肿瘤类型具有表观遗传学异质性和功能异质性。Litzenburger等人用scATAC-seq证明染色质可及性的差异与癌细胞系对药物的敏感性有关。
尽管单细胞表观基因组学拥有前景，但还没有一种完整的表观基因组学方法能够同时捕获所有水平的表观遗传修饰。然而，随着单细胞表观基因组分析方法的发展，研究人员期望在胃肠组织和疾病中得到应用。
单细胞代谢组学
代谢物是小分子产物（通常少于2000da），包括氨基酸、糖、脂质、小肽和药物分解产物。这些分子可以调节细胞结构、能量、信号、酶调节和发病机制。分析代谢物是一项挑战，因为它们具有高度的动态性，具有巨大的结构多样性和许多异构体。单细胞分析由于代谢物不能被放大而引入了额外的需求，因此需要进行超灵敏的分析。MS是分析单细胞代谢组最广泛使用的技术。MS是无标签、无目标（它可以同时检测数千个分子）、敏感（fM检测限）和特异性（它可以区分小于0.001 Da的分子）。单细胞MS分析代谢组分的典型方法是从每种细胞类型中收集单一光谱特征的实验，或作为成像质谱实验，来可视化细胞内或组织微环境中的代谢物分布（图3A）。在所有情况下，需要特别注意确保在样品制备过程中细胞的代谢曲线不受干扰，因为一些代谢物的周转率相对较高。
大多数单细胞类型的代谢组学分析实验是在细胞培养或组织分离物上进行的。在MS分析之前，通过手动操作、荧光激活细胞分类、微阵列细胞打印或使用微流控设备分离目标细胞群。悬浮液和表面单细胞快速质谱分析技术取得了重大进展。例如，开发了一种单探针质谱取样技术来分析活的单癌干细胞。单探针质谱系统使用双孔毛细管将裂解和提取溶剂输送到细胞表面，并将分子提取物携带到质谱仪中进行电喷雾电离分析。通过将单个探针尖端直接与单个细胞接触，分散在玻片上，研究人员能够在不制备样品的情况下对活细胞进行单细胞代谢组学分析。
在通量方面的重大进展中，Neumann等人能够使用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）对30000个单细胞进行MS脂质分析。他们通过将细胞分离到载玻片上并使用多模式成像方法识别MS分析的细胞。荧光显微镜用于确定完整细胞的位置，以获取MALDI数据。利用这项技术，研究人员检测到超过500种脂质水平特征，使用t-SNE和Louvain-Jaccard聚类相结合，确定了101个明显不同的细胞簇。其他人则一直致力于将单细胞代谢谱分析扩展到更复杂的细胞系统和组织。例如，Portero等人将微取样与毛细管电泳和电喷雾电离质谱联用，实现活细胞和组织中原位代谢产物的定量。
MS仪器和数据处理的最新进展使成像MS的同时保持空间分辨率。成像MS实验通常在组织切片上进行，这些切片解冻并安装在MS兼容的玻片上。离子在组织的指定区域内的位置（像素）产生，从而产生每个像素的质谱。在一个单一的成像实验中，可以检测数百种代谢物，并通过在像素阵列上绘制每个分子的强度将图像可视化。
随着以提高空间分辨率和分子特异性为重点的技术的迅速发展，影像学和单细胞代谢组学分析技术正在发展中。这些创新可以得到更精确的空间保真度，更完整的分子覆盖，最终加深对组织微环境中分子特征和细胞间相互作用的理解。
单细胞蛋白质组学
细胞的结构和功能在很大程度上取决于蛋白质组。然而，在单细胞水平上对蛋白质表达的无偏和广泛的分析却缺乏相应的技术。单个细胞只含有皮克级的蛋白质总量，由于没有扩增策略，有效地分析这些微量样品是一个巨大的挑战。仪器的持续改进（如液相色谱、电喷雾电离和质谱）已将蛋白质检测限扩展到单细胞水平，但传统的样品处理与单细胞不兼容，例如蛋白质在孔板表面的非特异性吸附和低效的消化动力学。
最近的研究已经帮助研究人员克服了这个瓶颈，对单个细胞进行深入的蛋白质组分析现在是可行的。例如，一种用于样品处理的微流控方法nanoPOTS，将样品制备体积从几十或几百微升减少到约200纳升，大大减少表面暴露和相应的蛋白质损失，提高了蛋白质浓度，实现高效消化动力学。再加上蒸发控制机制、高度灵敏和微型化的纳米流动液相色谱法以及最新一代的质谱仪，nanoPOTS平台能够在无标签的单细胞分析中鉴定几百到1000多个蛋白质。
除了使样品制备小型化和提高分析仪器的灵敏度外，研究人员还使用串联质谱（TMT）对单个细胞进行了分析，这使得在一次液相色谱-质谱分析中可以测定多个单细胞蛋白质组。这种方法可以提高通量和蛋白质组覆盖率。Budnik等人首次将TMT标记应用于MS分析单个哺乳动物细胞，其中140个标记的单细胞在包含数百个细胞的样品存在下进行分析。来自每个细胞的多肽在MS/MS裂解后根据其相应的报告离子强度进行分类。重要的是，利用改进的样本处理效率和多路复用，TMT与小型化的样本处理相结合（图3B）。这些进展已应用于单细胞和微量样本的研究，包括与消化系统相关的研究。例如，用50μm分辨率对肝组织进行了剖面分析，对患有和不患有1型糖尿病的患者的单个胰岛的10μm切片进行了研究。研究人员能够在单个胰岛水平上比较这两个蛋白质组。在近3000种胰岛蛋白中，约300种在表达水平上存在显著差异。
与单细胞免疫印迹相比，基于MS的单细胞蛋白质组学可以在无偏见、无标记的分析中量化近1000个蛋白质/细胞，而单细胞免疫印迹是一种基于抗体的分析，旨在分析每个细胞中的少量蛋白质（约10个）。然而，每个细胞基本上都有自己的液相色谱质谱运行，因此单细胞蛋白质组分析需要更多的时间。这是基于MS的方法的一个障碍，使其无法被广泛采用。
对单细胞代谢组和蛋白质组进行分析，可以发现看似相同的细胞在功能上的差异，可用于治疗药物的开发。然而，在单细胞水平和接近单细胞水平上进行广泛蛋白质组和代谢组分析的技术尚处于初级阶段。在常规应用于人类研究之前，需要在覆盖范围、通量和自动化方面进行改进。
图3 基于MS的单细胞分析技术
整合多组学技术
为了全面了解细胞，研究人员需要整合基因组、转录组、表观基因组和代谢组的信息（图4）。因此，单细胞的综合多组学分析是下一个发展前沿。当前技术的示例包括同时分析转录组和染色质可及性图谱，以及转录组加上一组候选基因蛋白质标记。整合多组学方法可以揭示生物学和疾病表型不同层次的异质性，但是它们在人类研究中的应用前景仍然是个问题。
图4 整合多组学数据
图5 单细胞组学技术的成熟性
总结与展望
虽然没有一种单细胞组学分析技术可以在临床上常规应用，但许多技术应用于人类研究，并提供有关疾病发展和治疗的信息。每种技术应用于临床研究的程度取决于其在从微量样本生成数据方面的易用性、精确性和再现性（图5）。例如单细胞蛋白质组学，需要复杂的仪器，可能在短期内仅限于专门的用途。其他的，如基于液滴的scRNA-seq已经得到广泛应用。最近的一个研究报告了使用scRNA-seq分析的数据来指导药物诱导的超敏反应综合征的治疗。未来几年将是一个令人兴奋的时期，因为各种图谱将检测这些技术在生成数据方面的局限性，这些数据可以阐明基本的科学知识并为生物医学决策提供信息。
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