科研 | Cell Syst：CRISPRi-Knockdowns的多组学分析确定了酶在大肠杆菌代谢中缓冲减少的机制
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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论文ID
实验设计
实验结果
1. 诱导的CRISPRi系统能够识别速率限制酶
对于酶的动态敲低，我们使用了CRISPRi系统，该系统由染色体上aTc诱导的dCas9组成和质粒上组成表达的sgRNA (图1A)。为了评估这个CRISPRi系统的基因干扰动力学，我们以插入大肠杆菌基因组的YPet报告蛋白为目标。这些实验显示每个细胞的YPet含量呈指数级下降，表明YPet蛋白随着生长不断稀释(图1B)。由于dCas9表达的时间和目标的寻找，诱导物的添加和YPet的减少之间可能存在1 h的延迟，此外，仅在dCas9诱导物aTc存在的情况下，YPet的表达被抑制，显示出dCas9对CRISPRi系统的严格控制(图1B)，因此，CRISPRi允许我们从未抑制(野生型)水平开始动态地减少蛋白质的丰度。
为了进一步测试CRISPRi系统的动态，我们针对编码酶在嘧啶核苷酸生物合成的基因。所有的嘧啶酶对大肠杆菌在葡萄糖最低培养基上的生长是必需的，因此，当酶水平达到一个临界阈值时，嘧啶基因的敲除应该会导致生长缺陷。当在这个阈值时，目标酶会限制单磷酸尿苷(UMP)的生物合成，并最终影响生长(图1C)。在培养开始时补充aTc诱导dCas9的表达(诱导培养)，或者在细胞生长时不添加诱导剂(非诱导培养)。没有靶蛋白的对照菌株在诱导培养和非诱导培养中生长相似，这意味着仅表达dCas9不会导致生长负担(图1D)。所有嘧啶抑制的非诱导培养物生长情况都与对照组相似，这证实了CRISPRi系统的紧密性，而诱导培养表现出广泛的生长表型：敲除该途径的前两种酶(PyrB和PyrC)几乎不影响生长，而敲除PyrE会导致强烈的生长缺陷，PyrF和PyrD的抑制也会影响生长，但在诱导CRISPRi (5 h左右)后，这种影响出现的较晚。
总之，CRISPRi可以诱导蛋白质水平的动态下降(图1B)。在PyrF和PyrD敲除过程中，诱导物的加入和生长缺陷的出现之间的5小时延迟表明，目标蛋白会被生长稀释，直到达到一个临界水平，而PyrE菌株的早期生长缺陷表明，这种酶在野生型中已经在一个临界水平上表达。这与先前报道的k12来源的大肠杆菌中PyrE的次优表达一致，这是由PyrE基因上游的移码突变造成的，而相对较弱的生长缺陷的其他嘧啶敲除表明，这些酶不运作在一个临界水平，然而，另一种解释是这些靶点的sgRNAs较弱或没有功能，因此，我们下一步以几种sgRNAs为靶基因，设计了大肠杆菌中所有代谢相关基因的sgRNAs。
图1 具有CRISPR干扰的酶的动态敲除
（A） CRISPR干扰系统由一株整合到基因组中的大肠杆菌菌株（YYdCas9）和质粒上的sgRNA组成。（B） YYdCas9株基因组中整合的YPet的动态敲除。对于表达对照sgRNA（黑色）或靶向YPet（橙色）的sgRNA的细胞，显示了YPet荧光。将每光密度（OD）的YPet荧光标准化为对照sgRNA的未诱导培养物。（C）当一种酶的浓度达到一个临界水平时，击倒它会损害生长。目标酶是由CRISPRi抑制的基因编码的酶。（D）表达对照sgRNA或靶向编码嘧啶核苷酸生物合成酶的sgRNA的细胞的生长。通过补充200 nM aTc（蓝色）或未诱导dCas9（黑色）来诱导dCas9的表达。
2. 大肠杆菌的新陈代谢对酶的CRISPRi-Knockdowns是强有力的
最新的大肠杆菌代谢基因组规模模型iML1515包含1515个基因，我们构建了靶向这些基因的sgRNAs，使用阵列合成的寡核苷酸(图2A)，对每个基因我们都设计了4到6个针对编码链上不同位点的sgRNA。采用混合方法克隆得到的sgRNAs，随后转化为携带dCas9基因的大肠杆菌(图1A)。而对CRISPRi文库的测序显示，文库中有7177个独特的sgRNAs，针对的是iML1515模型1515个基因中的1513个(图S1;表S1)。我们培养13 h dCas9葡萄糖基本培养基，发现其没有感应,这很难改变文库的组成：单CRISPRi菌株的褶皱变化13 h后通常分布在1,而只有47 7177株(0.6%)显示褶皱变化> 2(图S1)，非诱导文库的稳定组成再次证实了CRISPRi系统的严格控制。随后，我们诱导dCas9表达，每隔1小时进行14h的下一代测序，跟踪文库组成(图2A)，每2小时，我们将培养物重新稀释到新鲜培养基中，以避免氧和营养的限制。为了评估可再生性，我们栽培了两个独立的菌株，单个CRISPRi菌株的适应度得分被量化为sgRNA计数的fold change，这在两个独立栽培之间是可重复的(图S2)。
为了探究库中7177个CRISPRi菌株的适应度分数的动态模式，我们使用k-means聚类分析它们的个体时间分布(图2B)。44%的CRISPRi菌株适应度分数在14小时内保持不变(A簇)，而另外32%的B簇菌株的适应度分数略有提高，这一簇包含了一个表达无靶标sgRNA的对照菌株(B簇中的橙色线，图2B)，表明适应度分数的增加是由于具有野生型生长的菌株的相对富集所致；然而，一些菌株比对照菌株有更高的适应度分数，这表明这些敲除带来了相对于野生型的竞争优势。14小时后，18个基因的敲除导致适应度评分>1.5(至少有两种sgRNAs，表S2)，这又表明这些基因在葡萄糖最低培养基上的表达不是最佳的。在大肠杆菌中，两种表达欠佳的基因编码了产生重要二级信使的酶：cyclic-AMP (cyaA)和ppGpp (relA)，观察结果与之前的一项研究一致，即cyclic-APM和ppGpp在大肠杆菌中的调控不是最优，我们证实了relA菌株在微滴板培养中的适形优势(图S3)。
C簇和D簇中剩余24%的sgRNAs分别造成轻度和重度适应度缺陷。D簇的s型动力学适应度分数表明，该簇中的CRISPRi菌株从库中退出，可能是因为基因敲除产生了代谢瓶颈。为了确定敲低造成代谢瓶颈的时间点，我们通过拟合适合度评分的时间过程s形函数，估计了每个CRISPRi菌株的“响应时间”(图2C;表S3)。响应时间被定义为敲低导致适应度降低50%的时间点，并且两个实验之间的响应时间是可重复的(图2D),而总共有253个基因被至少两种sgRNAs靶向，导致响应时间低于14 h，我们将这253个靶点称为代谢瓶颈基因(表S4)。大多数代谢瓶颈基因对4-6个sgRNAs有相似的反应时间：70%不同sgRNAs之间的反应时间差异小于±20%(图S4)。不同的sgRNAs结合在靶基因的不同位置，因此它们应该具有不同的抑制效率，然而，位置几乎没有影响响应时间(图S4)。这一结果表明，抑制效率对响应时间的影响小于目标特异性因素。
代谢瓶颈基因占多数(253个中的203个，占80%)是葡萄糖培养基上生长所必需的(图2E)。根据iML1515模型的模拟，253个代谢瓶颈基因中的224个(88%)编码的酶携带代谢通量与葡萄糖作为唯一的碳源；只有11个基因(4%)既不是必需的，也不是代谢通量的编码酶(表S4)。在11个基因中，有3个基因的适应度缺陷可以用极性效应来解释，因为必需的或携带的基因被编码在目标基因的下游和同一个操纵子中；剩下的8个基因可能具有以前未被发现的功能，对细胞适应性有强烈的影响。
253个瓶颈基因的平均响应时间为7.8 h，相对于7个响应时间低于4 h的最敏感靶标来说，相对较晚(图2F中的红点)。七个最敏感的靶点是：ilvE/ilvD操纵子、ppc、sucA、lpxC、cysD、pyrG和nrdA/nrdB操纵子。一种假设是，这些基因编码的酶主要完成速率消除的步骤，因此他们表达接近临界水平，例如，核糖核酸二磷酸还原酶(NrdAB)为DNA复制提供脱氧核糖核酸三磷酸肽(dNTPs)，以前的研究表明NrdAB是DNA合成的速率限制因子。同样，PEP羧化酶(Ppc)提供三羧酸(TCA)循环前体，用于生物合成20个氨基酸中的10个(贫血症)，因此，接近临界的Ppc水平可能会限制蛋白质的整体合成，而Ppc的过表达增加了大肠杆菌的生长速率，这一假设得到了支持。
总之，1513代谢相关基因中只有7个的响应时间低于4 h，然而，大多数敲低的反应晚于CRISPRi的减少(平均7.8 h)，这表明，大肠杆菌对降低大多数代谢酶的活性有很强的抑制作用，而且很少有酶达到过临界水平。接下来，我们想知道目标酶丰度减少的有多强烈，以及是什么机制缓冲了酶的减少。
图2 大肠杆菌代谢网络中1513个基因的动态敲除
（A）在大肠杆菌代谢的最新基因组规模重建（iML1515）中靶向1513个基因的CRISPRi文库。（B） 7177个sgrna折叠变化的K-均值聚类。时程数据聚类为k=4个聚类。方框图表示每个时间点每个簇中sgRNAs的分布。B群中的橙色圆点表示一种对照菌株，其表达的sgRNA没有靶标。（C） CRISPRi菌株的适应度评分动态示例（5个sgRNAs之间具有低变异性的ppc和5个sgRNAs之间具有高变异性的trpE）。sigmoid曲线拟合到每个sgRNA的时间进程。（D）实验一和实验二的反应时间。显示了1182个响应时间低于14h的sgRNA（实验1和实验2的平均值）。57个错误率超过20%的sgrna以红色显示。（E）维恩图显示了253个“代谢瓶颈基因”（蓝色）、葡萄糖最低培养基必需的基因（红色）和编码具有代谢通量的酶的基因（绿色）之间的重叠。(F)所有253个“代谢瓶颈基因”的响应时间。
3. CRISPRi加强特定的蛋白质组反应
为了探究CRISPRi下调目标酶的强度，我们测量了30个CRISPRi菌株的蛋白质组(图3A和表S5)。靶酶包括CRISPRi综合筛选中最敏感的靶标之一：Ppc，它能将PEP在大肠杆菌中转化为草酰乙酸。我们还包括了PckA，它催化了逆反应，并且应该与葡萄糖的生长无关；其他靶点分布在代谢子系统中，如糖酵解(Pts、Pgi、PfkA、PfkB、FbaA、GapA、Eno、TpiA、PykA和PykF)和氧化戊糖-磷酸途径(Zwf和Gnd)。从TCA循环中，我们选择了柠檬酸合成酶(GltA)和琥珀酸脱氢酶复合物(SdhABCD)的第一步催化，此外，氨基酸(AroA, IlvC, MetE，和GdhA)和核苷酸(Adk, PyrF, PurB，和PurC)或两者(Prs和CarAB)的生物合成途径中有8种靶酶；剩下的目标是硫同化中的CysH，氨基糖生物合成中的GlmS，以及异戊二烯途径中的Dxs。我们将这些菌株培养在微效板中，并在dCas9诱导4.5 h后测定其蛋白质体。在这个时间点，30个CRISPRi菌株中有10个出现了生长表型(图3B和S5)，每个菌株在dCas9诱导和未诱导的情况下共培养三次，共得到180份蛋白质组样本。
蛋白质组数据显示，所有目标酶的下降幅度相似(平均5.1倍，图3Ca n dS6)。在29个基因敲除的20个基因中，靶酶是所有1506个测定蛋白中下调最多的蛋白(图S7)；在未诱导的培养基中，目标酶几乎没有下降，表明CRISPRi体系是紧密的和可诱导的(图3C)；我们也确认了PfkA和MetEstrain的酶在更早的时间点也下调(图S8)，这支持了我们的假设，目标酶减少后诱导CRISPRi (类似YPet敲低，图1B)。
直观地看，靶酶下降越厉害，生长缺陷就越严重；然而，靶酶的降低与生长的降低之间没有相关性(图S9)，这再次表明，抑制效率对生长表型的影响要小于靶标特异性因素(例如，靶标酶自身的过度能力)，但我们观察到生长的减少与显著改变蛋白的数量之间存在相关性(2倍，p<0.05，图S9)，这说明有生长缺陷的菌株有更强的蛋白质组变化，而没有生长缺陷的菌株的蛋白质组是稳定的。然后，我们分析了这些蛋白质组变化是全局生长依赖的反应还是特定的蛋白质组变化。由于两对CRISPRi菌株之间蛋白质组变化的平均相似性仅为6%(图S10)，因此我们认为每次敲低都会导致特定的蛋白质组变化，例如，蛋白质组变化影响了不同的代谢子系统(图S11)，在一些CRISPRi菌株(Pts、AroA、MetE、CarAB和IlvC)中，与目标酶相同的代谢子系统中的酶上调(图S7中的绿色点)。
总之，CRISPRi将靶酶的丰度平均降低了5倍(图3C)。靶酶的降低对19株CRISPRi的生长影响不大，而10株CRISPRi的生长速率在采样时间点前1 h左右下降(图3B)，因此，大肠杆菌的代谢耐受大量的酶水平下降，我们接下来想知道是什么机制维持这种稳健性。
图3 30个CRISPRi菌株的生长缺陷和靶酶丰度
(A) 29个CRISPRi菌株的目标酶代谢图。(B) 30株CRISPRi菌株的生长曲线。(C)条形图显示有诱导剂(蓝色)和无诱导剂(灰色)培养物中目标酶的丰度。
4. 底物和变构效应物对酶的CRISPRi-Knockdowns反应
为了了解大肠杆菌的代谢对靶酶5倍减少的反应，我们测量了30个CRISPRi菌株的代谢，我们在与蛋白质组样品同时采集代谢组样品(4.5 h)，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定119个细胞内代谢物，底物代谢物对酶的敲除反应强烈且特别明显(图4)：在29个敲除中，有18个底物增加了2倍以上，是变化最大的代谢物之一，而产物比底物更稳定(图4和S12)，这一观察结果与一项对酵母的研究是一致的，该研究表明，底物的增加可以维持通量和全球代谢物稳态。
在四个菌株中，目标酶的变构效应物对敲除反应最强烈(CarAB, GlmS, Ppc和Zwf；图4)，例如鸟氨酸是氨基甲酰磷酸合成酶(CarAB)的变构激活剂，在CarAB敲除后鸟氨酸增加了512倍。由于大肠杆菌中的鸟氨酸水平比CarAB的激活通常低37倍，鸟氨酸的增加应导致卡宾体内活性提高92%(图S13)，因此，鸟氨酸对CarAB的变构激活可以缓冲CarAB的敲除，同样，Ppc的敲除降低了天冬氨酸(13倍)和苹果酸(16倍)的浓度，这两种物质都是Ppc的变构抑制剂。苹果酸和天门冬氨酸的绝对浓度高于各自的抑制常数，因此，天冬氨酸和苹果酸的降低应能缓解对Ppc的抑制，在Ppc敲低时，Ppc的活性增加了4.1倍(图S13)。在GlmS和Zwf菌株中，我们观察到类似的变构抑制缓解，因为它们各自的反应产物葡萄糖胺-P和NADPH降低了，这与之前的研究结果一致。研究表明NADPH的降低、Zwf释放过剩能力以及葡萄糖胺-P是一种有效的GlmS活性抑制剂。
总之，酶的敲除导致了特异性和局域的代谢改变：22个CRISPRi菌株显示出强烈的浓度变化，要么是底物代谢物，要么是靶酶的已知变构效应物。在4个CRISPRi菌株(Dxs、GapA、Prs和IlvC)中，虽然在Dxs敲除过程中产物代谢产物(1-脱氧木酮糖5-磷酸)显著降低，但我们不能将已知的载体直接连接到靶标酶上，这可能是酶的未知调节因子。其他三种CRISPRi菌株没有显示代谢组变化，因为目标酶没有使用葡萄糖(Pck)或一个小同工酶(PfkB和PykA)。CRISPRi菌株中局部和特异性代谢组的变化与之前关于酶水平扰动的研究一致，暗示局部代谢物变化可以缓冲全球变化。接下来，我们试图获得进一步的证据来证明三种CRISPRi菌株(CarAB、MetE和Gnd)代谢物浓度变化的缓冲功能。
图4 30个CRISPRi菌株的代谢组变化是局部和特异性的
30株CRISPRi菌株中119种代谢物的细胞内浓度。在诱导和未诱导培养物之间，代谢物水平显示为对数2倍的变化。
5. 鸟氨酸缓冲了CarAB的抑制
尽管变构效应物具有抑制缓冲的潜力，但它们可能对CRISPRi没有反应，因为它们是调节因子，且它们位于目标酶的上或下游，例如，鸟氨酸含量的增加很可能是因为鸟氨酸碳甲酰基转移酶(ArgF和ArgI)由于低水平的肉甲酰基磷酸而受到限制(图5A)，这也意味着鸟氨酸对CarAB的变构激活不能完全补偿CarAB的敲除，但是鸟氨酸有缓冲功能，减轻敲低的后果。为了了解鸟氨酸在CarAB敲低中的调控作用，我们开发了一个CarAB和精氨酸-嘧啶分支点的小代谢模型(STAR方法和图5A)。根据体外参数，我们从有生理意义的范围内随机抽取模型动力学参数1000次，对于1000个参数集中的每一个，我们使用两种不同的模型模拟了CarAB的敲除：第一种模型包括鸟氨酸对CarAB的变构激活(变构模型)，而第二种模型不包括这一调控(非变构模型)。与非变构模型相比，变构模型在抗CarAB敲除方面更为稳健(图5B)，特别是在变构模型中，通量保持相对恒定：1000次模拟中有796次维持了初始稳态通量的95%，而在非变构模型中，流量持续下降，约为初始稳态的50%。
此外，变构模型中终产物精氨酸和UTP/CTP的浓度比非变构模型中更稳定。这些模型结果表明鸟氨酸对CarAB的变构激活可以最大限度地减少精氨酸和嘧啶核苷酸生物合成中代谢通量和最终产物的干扰。
为了证实模型结果，我们在敲低CarAB时动态测量代谢物(图5C)。与仿真结果一致，鸟氨酸已经增加了40分钟后感应CarAB敲低，而最终产品，精氨酸、CTP、UTP保持相对恒定的至少2 h。鸟氨酸的快速响应表明敲低CarAB扰乱精氨酸-嘧啶分支点CRISPRi的早期诱导。然而，扰动没有传播到两种途径的最终产物，因此，代谢模型和动态代谢物数据的结合提供了额外的证据，证明鸟氨酸具有缓冲CarAB敲除的潜力。
图5 鸟氨酸缓冲了CarAB敲除
(A) CarAB与精氨酸-嘧啶分支点动力学模型的化学计量学。（B）具有1000个参数集（细线）的变构模型和非变构模型的模拟结果。粗线是1000次模拟的平均值。显示了r2的模拟反应速率以及鸟氨酸（orn，黑色）、氨甲酰磷酸酯（cbp，紫色）、精氨酸（arg，蓝色）和UTP/CTP（橙色）的代谢动力学。(C)测定CarAB基因敲除中orn、arg、UTP和CTP的浓度。代谢产物水平归一化到诱导前的时间点。
6. 腺苷蛋氨酸在MetE抑制中引起蛋氨酸途径的代偿性上调
代谢物变化也可以通过代谢物和转录因子之间的变构相互作用来调节基因表达，例如，S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是MetJ的变构激活因子，其中，MetJ是一种转录因子，控制蛋氨酸和SAM生物合成涉及的基因(图6A)。在MetE敲低中，SAM是减少最多的代谢物(图4)，MetE菌株中蛋氨酸生物合成途径的所有酶均上调(除了靶MetE，图6B)，因此，我们推测低水平的SAM抑制了转录因子MetJ，进而抑制了蛋氨酸和SAM生物合成酶编码基因的表达。为了证实MetJ对MetE基因的敲低反应，我们使用MetJ调控启动子在MetE菌株中表达GFP，结果发现，在诱导CRISPRi后，GFP表达增加了2小时，这表明MetJ对基因敲低有反应(图6C)，因此，我们得出结论，低SAM水平导致蛋氨酸途径的代偿性上调，这一假设得到了所有30个CRISPRi菌株中SAM水平的支持:只有2个菌株的SAM水平较低(MetE和Ppc菌株)，蛋氨酸生物合成酶仅在这些菌株中增加(图S14)。
接下来，我们想知道SAM-MetJ规则是否缓冲了MetE敲低，因此，我们在MetE菌株中补充了SAM，并预期这将防止SAM的减少，从而防止蛋氨酸途径的代偿性上调。在SAM存在的情况下，诱导的MetE应变的生长缺陷确实更强(图6D)，这表明SAM的降低缓冲了敲除。由于未诱导的MetE菌株不受SAM的影响(图6D)，因此在SAM存在的情况下，较强的生长缺陷并不是由于一般的毒性作用。
总之，蛋白质组和代谢组数据恢复了SAM和转录因子MetJ之间已知的变构作用，GFP启动子融合证实了这一调控在MetE敲除中是活跃的，而补充SAM支持了SAM缓冲MetE敲除的假设。与SAM-MetJ相互作用类似，代谢组/蛋白质组数据恢复了精氨酸和ArgR(在CarAB株中有活性)、乙酰丝氨酸和CysB(在MetE和CysH株中有活性)之间的相互作用，以及缬氨酸(在IlvC株中有活性)的转录衰减(图S14)，这突出了CRISPRi和多组学数据在识别体内功能的调节代谢-蛋白质相互作用方面的潜力。
图6 SAM缓冲了MetE敲除
(A)蛋氨酸与SAM的生物合成及转录因子MetJ调控示意图。(B)蛋氨酸中酶的丰度和SAM的生物合成。（C）用荧光报告质粒转化MetE敲除，荧光报告质粒表达MetJ调控启动子（pUA66-metB-GFP）的GFP。绿色显示诱导和未诱导培养物之间GFP/OD的倍数变化。OD的折叠变化以黑色显示。（D）诱导的MetE菌株（实线）和未诱导的MetE菌株（虚线）的生长，添加1 mM SAM（黑色）和不添加（橙色）。
7. 6-葡萄糖酸磷酸绕过Gnd抑制而激活ED通路
下调Gnd可增加6-磷酸葡萄糖酸盐(6PG)的浓度(图4)，并上调ED通路中的酶(图7A和7B)，因此，我们想知道6PG的增加是否与ED通路的上调有关。ED通路的转录受两个转录抑制因子调控：KdgR和GntR。虽然KdgR只控制编码ED酶的两个基因(Edd和Eda)，但GntR控制参与葡萄糖酸盐摄取的其他基因。这些基因编码的一种酶(GntT)在Gnd敲低中也被上调(图7B)，表明GntR对敲低有应答。GntR的活性被葡萄糖酸盐变构抑制(Izu et al.， 1997)，因此，我们推测6PG的积累会产生少量的葡萄糖酸盐，从而抑制GntR，降低edd和eda的转录，结果发现，在Gnd敲低时，葡萄糖酸盐的细胞内浓度增加了(图7C)。在未诱导的Gnd菌株中葡萄糖酸盐的浓度为50 mM，与野生型水平(42 mM)接近；诱导Gnd敲低使葡萄糖酸盐增加到184 mM，这可能足以抑制GntR和取消edd和eda的表达。
葡萄糖酸在Gnd敲低中的增加表明葡萄糖酸作为一种调节代谢物，它不是在代谢中起作用，而是在调节中。我们希望通过破坏葡萄糖酸6-磷酸和葡萄糖酸之间的相互转化来改变这种调节，因此，我们删除了Gnd敲除中的葡萄糖酸激酶(gntK)，这导致了Gnd敲除中更高的葡萄糖酸水平(246 mM 未诱导和620 mM诱导，图7C)。葡萄糖酸盐水平越高，ED酶的表达也越高(图7C)，ED酶丰度较高，进而降低了DgntK/Gnd敲除中的6PG水平，这表明ED途径是一个旁路，可以使过量的6PG溢出。
图7 6-葡萄糖酸磷酸缓冲Gnd敲除
(A) ED通路(Edd和Eda两种酶)和氧化戊糖-磷酸通路的示意图。（B）目标酶（Gnd）的折叠变化，以及由转录因子GntR（Edd、Eda和GntT）调节的所有测量蛋白质的折叠变化。(C)细胞内代谢物与(B)中相同。
结论
总之，Gnd敲除显示了ED通路的旁路功能，我们在之前的Gnd敲除中已经观察到这种情况。在本篇文章中，我们发现ED旁路的表达受6PG的调控，6PG首先转化为葡萄糖酸盐，然后与转录因子GntR相互作用。尽管存在表达杂乱，但这一机制可能确保了高稳定性的代谢通量或代谢网络进化过程中发生的突变。