细胞能量代谢分析技术在肿瘤研究中的应用

更多实验室新鲜事请关注科享家视频号

正常细胞中代谢活动产生的能量消耗主要依赖于线粒体氧化磷酸化（OxPhos），而在肿瘤细胞中则多表现为疯狂地摄取葡萄糖进行有氧糖酵解。德国科学家Otto Warburg在1920年最先描述了这种在肿瘤细胞中产生能量的途径，因此，这种现象也被称为Warburg effect。

肿瘤的发生可由癌基因或抑癌基因的突变引起，这些遗传突变直接或间接调节代谢酶的表达及活性，影响肿瘤信号转导途径和细胞反应。同时，肿瘤细胞对营养素的需求异常增加，以维持其苛刻的合成代谢需求和能量产生率，也影响周围正常组织。肿瘤细胞具有更高的代谢可塑性，能够以重塑肿瘤微环境的方式更好地适应较低或不断变化的营养状况。

分析肿瘤细胞代谢和信号通路之间的相互作用，了解影响肿瘤微环境的调节机制可以揭示肿瘤治疗的新途径，为基于新陈代谢的抗肿瘤药物寻找潜在的治疗靶标。

接下来，我们将分享几个细胞能量代谢分析技术在肿瘤代谢检测中的应用。

文献一：

MTR4是与核外泌体相关的RNA解旋酶，在RNA加工和监视中起关键作用。本研究发现MTR4在肝癌细胞中表达升高，并可做为预测肝癌患者预后不良的独立诊断标记。MTR4通过调节糖酵解关键基因（如GLUT1和PKM2）mRNA的可变剪接来驱动癌症的代谢。

RNA测序结果发现，敲除MTR4可导致肝癌细胞中糖酵解途径的失调及几种关键糖酵解基因的表达降低，提示MTR4可能在肝癌细胞糖酵解代谢中发挥作用。进一步通过细胞能量代谢分析技术SeahorseXF检测细胞的胞外酸化率（ECAR）和细胞的耗氧率（OCR），与对照相比，MTR4的敲除可导致肝癌细胞的糖酵解降低及细胞的线粒体呼吸增强，氧化磷酸化水平升高，表明MTR4驱动了胞内代谢从氧化磷酸化向糖酵解的转变（图1）。

图1、肝癌细胞的糖酵解需要MTR4。

为深入了解MTR4驱动的糖酵解和肿瘤发生的潜在机制，研究人员在MTR4敲除的肝癌细胞中异位表达其下游关键糖酵解基因GLUT1，检测细胞的ECAR，发现GLUT1的过表达可挽救由于MTR4敲除导致的糖酵解水平降低（图2）。以上结果表明 MTR4在癌症胞内的氧化磷酸化和糖酵解的代谢转换中发挥重要作用。

图2、在MTR4沉默后，GLUT1的异位表达可以挽救肝癌细胞的糖酵解水平降低。

文献二：

BACH1为氧化应激反应的关键因子，可直接与抗氧化剂基因启动子中的ARE结合，并充当细胞内血红素水平的分子传感器。长期补充抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和维生素E会通过降低游离血红素水平和稳定转录因子BACH1促进KRAS驱动的肺癌转移。

本研究中，使用细胞能量代谢分析技术Seahorse XF对细胞的OCR和ECAR进行分析，研究人员发现与对照组（mTC）相比较，抗氧化剂处理的细胞（mTN）中的糖酵解率升高50％，OCR/ECAR比相应降低。为确定BACH1是否在功能上参与了糖酵解的增加过程，对其进行过表达后发现，肺癌细胞中的糖酵解随之增加，相反，BACH1缺陷的mTN细胞的糖酵解率则有所降低（图3）。

图3、抗氧化剂以BACH1依赖的方式刺激糖酵解。

为进一步确定癌细胞的侵袭能力和糖酵解水平是否相关，过表达BACH1的下游糖酵解关键基因HK2，可增加mTC细胞的糖酵解和迁移能力，而过表达人葡萄糖-6-磷酸酶的催化亚基则可降低糖酵解速率和mTN细胞的迁移。敲低HK2可反转BACH1诱导的糖酵解和细胞迁移能力。高糖酵解速率可以提高ATP的产生速率和总ATP含量，从而促进细胞运动。mTN细胞糖酵解产生ATP的速率和总ATP产生的速率，都高于对照组细胞（图4）。表明抗氧化剂以BACH1依赖的方式刺激糖酵解，并促进癌细胞侵袭。

图4、HK2刺激的糖酵解驱动抗氧化和BACH1依赖的迁移。

文献三：

细胞因子诱导的含SH2的蛋白（CIS；由基因CISH编码）是自然杀伤（NK）细胞中白介素15（IL-15）信号传导的关键负调控因子。使用诱导的多能干细胞衍生的NK细胞（iPSC-NK细胞）敲除人CISH基因后，CISH ^-/- iPSC-NK细胞表现出改善的代谢适应性，敲除人类iPSC来源的NK细胞CISH能够发生代谢重编程，从而促进体内持久性并增强抗肿瘤活性。

本研究中使用细胞能量代谢分析技术Seahorse XF检测NK细胞的糖酵解和OxPhos的速率。低浓度IL-15中培养3天或7天后，CISH ^-/-iPSC-NK细胞的糖酵解速率比对照细胞WT iPSC-NK和PB-NK细胞都有所增加；培养7天后，CISH ^-/- iPSC-NK细胞中的OxPhos也明显增加（图5）。

图5、人iPSC-NK细胞中CISH的缺失改善了代谢适应性。

雷帕霉素复合物1（mTORC1）在哺乳动物合成代谢和营养吸收中发挥重要作用。使用mTORC1抑制剂-雷帕霉素（rapa）处理CISH ^-/-iPSC-NK和WT iPSC NK细胞，导致CISH^-/- iPSC-NK细胞糖酵解减少和线粒体呼吸减少。rapa完全中和了CISH ^-/- iPSC-NK细胞中改善的糖酵解和OxPhos，使代谢率达到了与WT iPSC-NK细胞相似的水平。结合其它功能实验，说明CISH^-/- iPSC-NK细胞代谢适应性的改善是由mTOR途径介导（图6）。

图6、CISH^-/- iPSC-NK细胞代谢适应性的改善由mTOR信号通路介导。

文献四：

肿瘤微环境中癌细胞和浸润的免疫细胞争夺有限的营养物质。本研究探讨了肿瘤微环境中细胞亚群对葡萄糖和谷氨酰胺的获取和摄取。

使用细胞能量代谢分析技术Seahorse XF检测肿瘤微环境中CD45^-癌细胞、CD3⁺T细胞、CD11B⁺髓样细胞和F4/80⁺巨噬细胞的ECAR和OCR。与肿瘤浸润的T细胞和CD45^-癌细胞相比，分离的F4/80⁺巨嗜细胞维持较高的基础胞外酸化率和基础线粒体耗氧率。结合FDG亲和力实验结果，肿瘤微环境中的巨嗜细胞消耗的葡萄糖最多，并保持强大的葡萄糖代谢（图7）。

图7、肿瘤微环境中的髓样细胞比癌细胞消耗更多的葡萄糖

接着检测了rapa处理的上述肿瘤微环境中细胞亚群的代谢活性。发现雷帕霉素处理使离体的髓样细胞的基础细胞胞外酸化率和基础线粒体耗氧率下降，而癌细胞和T细胞则保持不变，结合其他细胞和分子实验结果，表明mTORC1参与了肿瘤微环境中细胞的葡萄糖摄取和代谢（图8）。

图8、mTORC1支持肿瘤微环境中细胞的葡萄糖摄取和代谢。

参考文献：

[1]Jie,Z. Energy metabolismof cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation. Oncology letters, 2012,4(6):1151-1157.

[2] Reina-Campos M ,  Moscat J , Diaz-Meco M . Metabolism shapes the tumor microenvironment. CurrentOpinion in Cell Biology, 2017, 48:47-53.

[3] Yu L, Kim J, Jiang L, etal. MTR4 drives liver tumorigenesis by promoting cancer metabolic switchthrough alternative splicing. Nature Communications.2020,11:708

[4] Wiel C,Le Gral K,IbrahimMX, et al.BACH1 Stabilization by Antioxidants Stimulates Lung CancerMetastasis.Cell. 2019, 178: 330-345

[5] Huang Z , Blum R H ,Bernareggi D , et al. Metabolic Reprograming Due to Deletion of CISH in HumanNatural Killer Cells Promotes in vivo Persistence and Enhances Anti-TumorActivity. SSRN Electronic Journal, 2020.

[6]BradleyI R, Matthew Z M, Melissa M W, et al.Cell-programmed nutrient partitioning inthe tumour microenvironment. Nature, 2021.

END