科研│PLANT PHYSIOL(IF：6.902) ：转录因子EIL1参与缺硫反应的调节
编译：微科盟秦时明月，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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硫是细胞不可或缺的组成部分，是植物生长的大量营养元素。因此，缺硫反应有助于植物应对有限的硫供应。在转录水平上，这种反应由SLIM1控制，SLIM1是 EIL转录因子家族的成员（图1）。在这项研究中，研究人员确定EIL1是调节缺硫反应的第二个转录激活因子，从属于SLIM1/EIL3亚族。本研究对拟南芥(Arabidopsis thaliana)的全转录组测序分析使研究人员能够获得缺硫反应的完整图谱，并量化这两种转录因子的贡献。研究人员证实了SLIM1/EIL3在控制反应中的关键作用，特别是在根中，但在叶中超过50%的反应是独立于SLIM1/EIL3和EIL1的。转录组测序显示EIL1对缺硫反应的调节有额外贡献，也鉴定了通过EIL1特异性调节的基因。SLIM1/EIL3似乎具有进一步的功能(例如，在调节对低氧反应的基因或在低硫和正常硫供应下介导防御方面)。这些结果有助于剖析缺硫反应的机制，并为改善植物对缺硫条件的适应提供了新的见解。
论文ID
原名：The Transcription Factor EIL1 Participates in the Regulation of Sulfur-Deficiency Response
译名：转录因子EIL1参与缺硫反应的调节
期刊：Plant Physiology
IF：6.902
发表时间：2020年12月
通讯作者：Stanislav Kopriva
通讯作者单位：德国科隆大学植物科学研究所
DOI号：10.1104/pp.20.01192
实验设计
结果
1 EIL1的缺失影响缺硫时含硫代谢物的积累
作为评估EIL家族对缺硫反应重要性的第一步，研究人员构建了双突变体eil3/eil1，并测试了它和单突变体对缺硫的反应。将eil3 T-DNA插入突变体与最初的slim1-1和slim1-2突变体进行比较，发现对缺硫的转录反应显示出非常相似的缺陷。Columbia-0 (Col-0)野生型、eil1、eil3和eil3/eil1幼苗在培养基平板上生长18天，该平板具有全硫或低硫供应，并分析了阴离子、硫醇和硫代葡萄糖苷的水平。在对照植物中，eil3和eil3/eil1突变体芽中的硫酸盐水平降低了约50%，但在根中保持不变(图2A)。硫酸盐水平对硫酸盐缺乏的反应强烈减弱，但eil3/eil1的芽除外，其硫酸盐水平的减少与野生型或单一突变体相比减弱了。eil3和eil3/eil1的叶片半胱氨酸(Cys)水平在对照条件下高于野生型和eil1，但在低硫条件下低于野生型和eil1(图2B)。因此，在野生型和eil1中，对照和缺硫条件之间的Cys浓度没有或只有很小的差异，而SLIM1被破坏的基因型在Cys上表现出很大的差异。缺硫植物叶片中的谷胱甘肽显示出与半胱氨酸相似的模式，eil3和eil3/eil1的水平低于野生型(图2B)。然而，在对照条件下，eil1突变体积累的谷胱甘肽比其他基因型少。同样，谷胱甘肽的减少在缺硫的eil3和eil3/eil1中比在野生型和eil1中更明显。对于脂肪族芥子油苷的地上部水平，也观察到减弱的缺硫反应(图2C)。在正常硫供应下，与野生型相比，所有三种突变体的硫代葡萄糖苷水平都有所降低。而在野生型和eil1中，脂肪族硫代葡萄糖苷因缺硫而降低，这种降低在eil3中不明显，在eil3/eil1中甚至更少。除了在eil1和eil3/eil1突变体中的控制条件略有降低之外，吲哚芥子油苷在突变体之间没有表现出显著差异(图2C)。这些结果表明EIL1参与了缺硫下对硫代谢的调节。
图1. SLIM1/EIL3在调节缺硫反应中的作用以及与EIN3/EIL1在乙烯信号转导中的作用的联系。
图2. eil1、eil3和eil3/eil1的代谢物分析。硫酸盐含量(A)通过离子色谱法测定，而硫醇(B)和硫代葡萄糖苷(C)含量通过高效液相色谱法测定。
2 在缺硫条件下，维持硫的吸收和分配需要EIL1
为了评估EIL1的突变是否也影响硫酸盐同化，测定了35S在不同突变体硫醇、硫代葡萄糖苷和蛋白质中的掺入，以及总的吸收和根冠易位。拟南芥通常通过高亲和力的硫酸盐转运蛋白增加根对硫酸盐的吸收来适应缺硫条件。这种反应在野生型幼苗中明显可见，并伴随着从根到茎(同化作用的主要场所)的硫酸盐转移增强。在eil1幼苗中，吸收和转运的增加显著减少，而在eil3中，缺硫反应被完全消除(图3A)。双突变体幼苗受到的影响甚至更强，因为它们的硫酸盐吸收和转运不仅在缺硫条件下最低，而且在正常硫供应下已经受损。
在谷胱甘肽中掺入35S也观察到类似的模式(图3B)，这也对应了先前观察到的谷胱甘肽水平降低(图2)。尽管缺硫导致硫代葡萄糖苷积累减少，但野生型硫代葡萄糖苷的通量没有变化，而在eil1中略有增加。事实上，在缺硫条件下，eil3和eil3/eil1幼苗的硫代葡萄糖苷含量是eil1和野生型的两倍，这可能是因为GSH作为核心硫代葡萄糖苷合成的硫供体具有更高的比活性，并且缺硫诱导基因1 (SDI1)的上调作用减弱。在这两种情况下，将35S掺入蛋白质并没有显示出突变体和野生型之间的任何改变。野生型、eil1、eil3和eil3/eil1的硫代谢对缺硫反应的降低幅度清楚地表明eil1在缺硫反应的控制中起作用。此外，这表明两种转录因子对硫酸盐的获得、分配和同化的调节都具有附加功能。
图3. eil1、eil3和eil3/eil1硫酸盐同化通量。A 通过计数器测定硫吸收和根冠易位。B 35S与谷胱甘肽和硫代葡萄糖苷的结合。
3 EIL1对缺硫标记基因的调节作用
缺硫导致拟南芥大量基因发生表达变化，如SDI1和γ-谷氨酰环转移酶2；1 (GGCT2；1)，以SLIM1依赖的方式上调，而其他的，如APR亚型，被证明是不依赖SLIM1的。因此，研究人员测试了EIL1是否有助于缺硫对这些标记基因的调节。SDI1和GGCT2；1的转录水平分别参与脂肪族硫代葡萄糖苷生物合成和谷胱甘肽分解代谢的调节，在芽和根的缺硫条件下在野生型幼苗中高度上调(图4)。eil3突变体的这种反应在两个器官中都显著降低了约50%，SULTR1；1在根中也一样(图4B)，但在叶中APR3在eil3和野生型中被上调到相同的程度(图4A)。EIL1的缺失不影响叶片的缺硫反应；然而，在根中，SDI1和GGCT2；1的上调衰减程度与eil3相同， SULTR1；1介于野生型和eil3之间(图4)。SLIM1和EIL1的缺失同时导致基因表达的累加效应；在叶中，eil3/eil1的SDI1和GGCT2；1转录水平受缺硫的影响明显小于野生型和单突变体。在根中也是如此，特别是SULTR1；1的上调很低。这些发现清楚地表明，EIL1参与了缺硫反应的转录调节，它似乎调节SLIM1之外的基因转录。
图4. eil1、eil3和eil3/eil1缺硫标记基因的表达分析。通过RT-qPCR测定缺硫标记基因SDI3、SDI1和GGCT2；1在叶中(A)和根中(B) SULTR1；1、SDI1和GGCT2；1的相对基因表达量。
4 缺硫反应中EIL1和EIL3的整体转录网络
为了获得缺硫反应中的整体转录网络，研究人员对四种基因型植物的茎和根进行了全转录组测序。在正常硫供应下，与野生型相比，eil3和eil1的叶片中分别有179和98个基因差异表达(图5A)。在双突变体中，DEG的数量增加到238。其中，13个基因在单突变体和双突变体中都有差异表达，但eil3和eil1分别有68和64个特异DEGs。共有128个基因仅在双突变体中差异表达。在eil3突变体中，几个但不是所有典型的缺硫标记基因(LSU1、LSU2、LSU3和SDI1)被轻微但显著地诱导，而在eil3/eil1中，它们被诱导到稍高的水平，并且在诱导的DEG中还发现了APR2和APR3。为了确定突变体中差异调节的过程，进行了GO注释分析。在正常的硫供应下，SLIM1受影响基因的缺失被注释为参与对缺氧和氧水平、对其他生物胁迫和水杨酸以及对避光的反应(图6A)。在eil1中的DEGs，除了一些参与对热和活性氧(ROS)的反应以及茎和花发育的基因外，对缺氧和氧水平的反应基因也过多，这与EIL1在乙烯信号传导中的作用一致。在根中，在正常硫供应下，eil3和eil1中分别发现103和64个DEGs，在双突变体中发现117个DEGs，在所有三个突变体中有16个基因共差异表达。这些基因中的大多数都以器官特异性的方式受到影响；eil1和eil3的根和芽中分别有2和12个基因差异表达，在eil3/eil1双突变体中增加到16个基因(占根基因的13.6%)。在单个突变体eil1和eil3的根中，没有功能类别被注释。然而，在eil3/eil1根中，除了对几丁质、氮化合物和寒冷的反应(图6A)之外，对缺氧和氧水平的反应基因再次被注释。总的来说，在所有三种基因型中，高比例的GO术语与应激反应有关(图6A)。
在缺硫条件下，野生型和单个突变体之间叶片中的DEGs数量分别显著增加到598和3489(图5A)。在所有三个突变体中有40个基因共差异表达。在根中，eil1和野生型之间在缺硫条件下检测到95个DEGs，eil3中检测到292个，双突变体中检测到530个，其中48个在所有三种基因型中共差异表达。在eil3和eil3/eil1中，根和芽之间的重叠稍大，其中70个基因(根DEGs的23.6%)和188个基因(根DEGs的35.5%)在根和芽中都有差异表达，而eil1中只有4个基因在两个器官中都受到影响。
缺硫对基因表达有很大影响,分析显示野生型的芽和根中分别有1258和335个缺硫调节基因(图5B)，如MIR395、LSU1、LSU2、SULTR11，SULTR12，SULTR21、SHM7、APS3、APS4、APR2、APR3、SERAT32、SDI1、CYP83A1、BCAT4、MAM1、BGLU28、GGCT21,这些基因编码参与硫酸盐摄取和分配、活化和还原、Cys生物合成、芥子油苷生物合成以及次级硫化合物分解代谢的蛋白质，因此覆盖了硫酸盐同化途径的很大一部分。而在eil1和eil3的叶片中，与野生型相似数量的基因差异表达，分别为1210和1414，在eil3/eil1中发现了几乎四倍多的DEGs (4527)(图5B)。在根中，与野生型相比，所有突变体中的DEGs数量都减少了，eil3中只有61个DEGs (图5B)。
图6. 功能富集分析。A 正常条件下，eil1、eil3和eil3/eil1中的GO注释分析。B 在对缺硫有反应的SLIM1和EIL1依赖基因的GO注释分析。
5 SLIM1和EIL1对缺硫反应的贡献
为了确定SLIM1和EIL1对缺硫反应的贡献，研究人员将SLIM1和EIL1调节基因定义为在野生型中正常表达而在突变体eil3和eil1中差异表达的基因，或者在突变体中表达变化至少比野生型低两倍的基因。在根中，在野生型的335个DEG中，211个由EIL1调节，278个由SLIM1调节(图7)。其中，198个基因受两种转录因子调节，13个受EIL1调节但不受SLIM1调节，80个受SLIM1调节但不受EIL1调节。因此，SLIM1负责调节根中83%的缺硫反应，与硫酸盐同化作用、硫化合物转运和硫代葡萄糖苷合成相关的GO注释都高度富集(图6B)。在EIL1依赖的缺硫反应基因中，没有一个GO注释被富集。在SLIM1非依赖性基因中，有两种APR亚型，APR2和APR3，以及几种芥子油苷合成酶的基因，CYP79B2，FMO_GS-OX3，AOP2，以及SOT17。芥子油苷的合成也是根中SLIM1非依赖性基因中含量最高的GO注释。其他与SLIM1无关的基因包括氨基酸和有机酸代谢基因。几个硫代葡萄糖苷相关基因(CYP79B2，FMO_GS-OX3，IPMI1)受缺硫的调节方式与eil3和野生型相同。
在叶片的1258个DEGs中，372个受EIL1控制，553个基因受SLIM1调控，278个基因受二者共调控(图7)。在这278个基因中，59个在eil3/eil1突变体中被正常调节，这表明这两个因子对这些基因的调节相反。双突变体中两种转录因子的缺失影响了667个受叶片缺硫调节的基因，因此它们在叶片中的作用比在根中的作用弱。这667个基因包括191个仅不同于野生型的基因。在这191个基因中还有许多与芥子油苷相关的基因以及APR1和APR3，但没有APR2。eil3/eil1的DEG富含参与硫化合物代谢的基因，包括谷胱甘肽和硫代葡萄糖苷。
SLIM1被认为是硫酸盐同化途径的关键调节因子，但其参与的完整程度尚不清楚。为了量化SLIM1和EIL1对缺硫调节途径的贡献，构建了所有与硫酸盐同化相关的基因和相关途径的热图，表明SLIM1和EIL1在很大程度上负责调节硫酸盐的吸收和初级同化途径(APR除外)，并另外调节芥子油苷的生物合成和分解代谢。另一方面，这两种转录因子在蛋氨酸、谷胱甘肽和乙烯的生物合成中似乎只有很小的作用。比较所有四种基因型的基因表达显示，EIL1通常作为SLIM1的辅助基因。此外，硫代谢中的许多基因不受SLIM1或EIL1的转录调节。
对SLIM1应答基因的分析表明，SLIM1除了调节缺硫应答外，还具有其他功能。在地上部和根部，eil3幼苗在缺硫条件下与野生型相比，分别有399和154个基因差异表达。GO富集分析揭示了编码与应激反应有关的蛋白质的基因转录受SLIM1调节。此外，与脱落酸(ABA)反应、芥子油苷生物合成和硝酸盐转运相关的几个基因受SLIM1调节，但不受缺硫的调节。相比之下，缺硫反应似乎并不完全由SLIM1和EIL1控制。在所有四种基因型中，共有420个基因(33%)和23个基因(6.9%)受缺硫的调控程度相同。根转录物中有参与硫代葡萄糖苷生物合成的基因，如MAM3、SOT17、几种GST和CYPs，此外还有与硫酸盐主要同化途径直接相关的基因，如APR3、APK2、ATPS1、SERAT11，OAS-TLC和GSH1。有趣的是，几个与氧化还原相关的酶，如谷氧还蛋白和硫氧还蛋白，被发现是对缺硫有反应的，但在芽中不受SLIM1和EIL1的控制。
SLIM1和EIL1对整体缺硫反应的贡献表明，尽管根中上调和下调转录物的数量是平衡的，但大多数转录物在芽中上调(图8)。SLIM1和EIL1似乎在影响这部分转录本中发挥了重要作用。相比之下，研究人员的数据显示，很多基因的表达改变通常独立于这些转录因子控制。调节的程度进一步表明，SLIM1是更重要的调节物，EIL1主要具有辅助功能(图8)。
图7. SLIM1和EIL1对控制缺硫反应的贡献。
图8. SLIM1/EIL1对缺硫反应贡献的整体情况。
6 缺硫调控的新基因
由于以前对缺硫反应的研究是使用微阵列进行的，研究人员的转录组方法的另一个优势是有机会识别更多的基因，这些基因不包括在微阵列中。在芽和根中，分别有238和67个新基因在缺硫时差异表达。这些基因包括其他已知的缺硫反应基因的亚型，但也包括许多未描述的基因。例如，硫酸盐利用效率4(SUE 4；AT3G55880)，一种已经与缺硫和重金属以及氧化应激耐受性相关的基因；GLN DUMPER5 AT5G24920，7种参与氨基酸输出到质外体的跨膜蛋白之一；AT1G49640，编码具有甲基吲哚-3-乙酸酯酶活性的水解酶超家族蛋白；AT3G21351，编码一种在保卫细胞中表达的推定跨膜蛋白；AT2G18193，编码具有可能的ATPase活性和金属离子结合的蛋白质。此外，缺硫高度诱导了几个未知基因，如AT2G34655、AT1G22065和AT2G32487，后者与OAS簇的基因共调节。通过RT-qPCR验证了转录组测序结果，并揭示了AT1G22065和AT1G49640的转录水平以EIL1和SLIM 1依赖的方式响应缺硫而上调。另一方面，AT2G18193在野生型中对缺硫没有反应，并且在两种条件下都被EIL1和SLIM1抑制。有趣的是，AT2G18193在所有突变体的芽中都响应缺硫，在eil3/eil1中最高。这些基因可能代表硫调节网络的额外成分，但有待进一步鉴定。
结论
SLIM1对控制缺硫反应很重要，但对这种调节的机制知之甚少。SLIM1转录本优先在叶、下胚轴和根的脉管系统中表达，特别是在薄壁组织和木质部细胞中，但不受缺硫的影响。SLIM1蛋白在细胞核中的丰度和定位在缺硫时不会改变。因此，本研究分析了缺硫反应的分子机制和EIL家族在这一调节中的更广泛的作用。EIL1作为一个额外的转录因子调节缺硫反应。研究人员通过转录组测序比较了eil3、eil1和双eil3/eil1突变体对缺硫的转录反应，表明EIL1与SLIM1相比具有重叠和特异性功能。
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