国人高分综述 | Molecular Plant：植物中mRNA和DNA的表观遗传修饰
编译：菜鸟菠萝，编辑：十九、江舜尧。
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在信使RNA(mRNA)中N6-甲基腺嘌呤(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)以及DNA N6-甲基脱氧腺苷(6mA)的检测和定位的进展重新定义了科研人员对这些作为表观遗传调控修饰的附加层次的理解。在植物中，最普遍的内部mRNA修饰(m6A和m5C)在许多过程中发挥着关键的作用，包括胚胎发育、毛状体分枝、叶片形态相关发育、花的相关发育、胁迫反应、果实成熟和根发育。新发现并广泛存在的表观遗传标记6mA DNA甲基化与基因表达、植物发育和逆境反应有关。本文就mRNA和DNA表观遗传修饰的检测、动态、分布、功能、调控蛋白和进化等方面的最新研究进展进行综述，重点介绍m6A、m5C和6mA。本文还对植物中新发现的和未知的mRNA和DNA的表观遗传修饰的未来研究进行了展望。
论文ID
原名：Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants
译名：植物中mRNA和DNA的表观遗传修饰
期刊：Molecular Plant
IF：10.812
发表时间：2019年12月
通讯作者：谷晓峰
通讯作者单位：中国农业科学院生物技术研究所
DOI号：10.1016/j.molp.2019.12.007
介绍
1 引言
RNA的化学修饰首先在小牛肝脏RNA研究中发现，随后在所有生物中均发现存在RNA的化学修饰。目前，已发现160多种类型的RNA修饰，其中大多数发生在转移RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）中。最早报道的mRNA修饰是m6A，它首先在哺乳动物中被发现，随后在包括植物在内的其他真核生物中被发现。前期由于技术问题导致其发展缓慢，现在由于高通量测序的发展，mRNA修饰已得到相应的挖掘与验证。m7A 、m6A、m5C等mRNA修饰在发育和基因表达中有调节作用。在这些修饰中，m6A影响RNA代谢的几乎所有方面，包括mRNA衰减，翻译效率，3’末端加工和选择性剪接。尽管在植物中已知许多修饰的发生，但通过植物转录组分析仅检测到m6A、m5C和ᴪ。除mRNA修饰外，6mA DNA修饰也已被鉴定为一种新的表观遗传标记，并且得到了广泛的研究。在原核生物，古细菌和真核生物的基因组DNA（gDNA）中发现了DNA甲基化，例如5-甲基胞嘧啶（m5C）和6mA。哺乳动物和植物中最丰富的DNA甲基化在调节基因表达中起着至关重要的作用，因此通常被认为是重要的表观遗传标记。很早以前在植物和昆虫中发现了6mA DNA甲基化，但同期研究并未进行深入研究。但在其它几个真核物种中研究了6mA，包括非洲爪蟾，小家鼠，真菌，拟南芥，水稻。这些研究证明了6mA在真核生物中的广泛分布，这表明6mA是真核生物中的新型表观遗传标记。在这篇综述中，讨论了最近有关mRNA和DNA修饰的理解的进展，特别是关于植物中的m6A，m5C和6mA。还讨论了它们在转录组/全基因组范围内的作图方法和分布。然后，简要讨论了这些修饰的相关特征，并回顾了重要的甲基化酶（Writer），去甲基化酶（Eraser），特异性识别蛋白（Reader）及其进化。接下来，本文总结了mRNA修饰和6mA DNA甲基化的生物学和分子功能。最后，本文讨论了该领域当前尚待解决的问题和未来工作的方向。
2 m6A和m5C mRNA修饰的转录组全图
m6A是最丰富的mRNA修饰，并且是第一个在转录组范围内定位的内部修饰。2012年，两个小组独立开发了使用基于抗体的高通量测序（HTS）进行m6A定位的方法，即m6A测序（m6A-seq）和甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）。随后，开发了光交联辅助的m6A测序（PA-m6A-seq），此外，纳米孔测序利用电荷变化来检测RNA修饰，包括具有单核苷酸分辨率的天然单个RNA序列中的m6A。在植物中，m6A位点分布广泛，并表现出主要的m6A共有基序RRACH（R = A / G； H = A / C / U）以及其它谱系特有的m6A基序，例如URUAY。在整个转录组中，m6A通常在终止密码子和3'非翻译区（3'UTR）附近富集，这种模式在拟南芥和各种植物物种的不同发育阶段均得到保留。基于抗体的HTS，miCLIP和纳米孔测序也已用于绘制真核生物中的m5CmRNA修饰图。此外，已经使用RNA亚硫酸氢盐测序（RNA-BisSeq）绘制了整个转录组的m5C位点。m5C-RIP-seq，RNA-BisSeq和纳米孔测序已用于在拟南芥中绘制m5C的图，揭示了数千个m5C位点，其中大多数位于编码序列（CDS）上。然而使用RNA-BisSeq或m5C-RIP-seq进行检测时，检测结果不同，其中RNA-BisSeq分析，m5C似乎富含3'UTR，未发现共有基序，由m5C-RIP-seq鉴定的m5C富含CDS，但RNA-BisSeq和m5C-RIP-seq都有其优缺点，有待提高与改进。
3 植物中的动态mRNA修饰
使用薄层色谱，斑点杂交和LC-MS/MS在不同植物物种中对mRNA修饰水平的检查揭示了植物生长和发育过程中mRNA修饰的动态。在不同植物不同组织中均观测到许多组织特异性m6A修饰的基因和各种m6A序列。m5C的丰富度也是同样的情况。但不同组织和发育阶段的Writer，Eraser和Reader的基因表达水平不同，揭示植物中mRNA修饰的动态调节。
4 m6A Writer与MT-A70家族在植物中的进化，Eraser和植物中ALKBH家族的进化
mRNA的修饰是由保守的多组分甲基转移酶复合物催化m6A进行的。最近鉴定出的含锌指CCCH结构域的蛋白质13（ZC3H13）（图1）。在这些蛋白质中，METTL3和METTL14形成异源二聚体，其中METTL3是m6A催化亚基，METTL14是RNA结合位点，WTAP和VIRMA是调节亚基，RBM15/15B是相应的结合蛋白，将m6AWriter复合物转移到目标区域，而HAKAI在m6A甲基化中的分子功能目前未知。m6A甲基转移酶复合物在哺乳动物和植物之间似乎是保守的（图 1和2）。任何这些元件的敲除或降低会导致m6A水平降低。具有m6A催化活性的核心成分是METTL3，它属于MT-A70家族。在植物中，MT-A70家族蛋白可以分为三个亚家族（图3A），即MTA，MTB和MTC。系统发育分析表明，MTA和MTB的出现要比MTC早得多，而MTC可能在链霉菌内进化（图3A）。使用三个植物MT-A70序列和人类参考序列的比对表明，许多功能位点均得到了类似的保守结构区域（图3B），这表明植物MTA-MTB和人类METTL3-METTL14可能具有类似的催化甲基转移的机制。m6A的甲基化是可逆的，并且甲基可以通过m6AErase去除。在哺乳动物中，m6AErase的mRNA是ALKBH家族蛋白FTO和ALKBH5。在植物中，迄今为止鉴定出的m6A脱甲基酶包括属于ALKBH家族的ALKBH9B，ALKBH10B和SLALKBH2（图4）。但不存在FTO直系同源物。
图4 植物ALKBH家族的系统发育分析
5 m6A Reader和植物中的YTH域蛋白的进化
m6A通过集中Reader蛋白来介导其生物学功能。已经报道了几类m6AReader，包括含YTH（YT521-B同源性）结构域的蛋白质（YTH蛋白质），真核翻译起始因子3（eIF3）和不均一核糖核蛋白（HNRNP）家族。系统发育分析将植物YTH蛋白分为两类（图5A）。在拟南芥和水稻中已鉴定出11个进化上保守的C末端区域（ECT）（图5A）。第2组（YTHDC）包括YTHDC1，YTHDC2和其余的植物YTH蛋白，它们形成两个亚组（图5A）。酵母参考序列与拟南芥YTH蛋白之间的比对表明，其与RNA结合高度保守（图5B），这表明拟南芥中的其它YTH蛋白也可能是m6AReader。
图5 植物中含有YTH结构域的蛋白质家族的系统发育和比对分析
6 植物中的m5C调节蛋白和RCMT家族的进化以及对根发育中mRNA的修饰
NOP2/Sun结构域蛋白2（NSUN2）催化人类中的m5CmRNA修饰，其植物同源物tRNA特异性甲基转移酶4B（TRM4B）属于RNA（m5C）甲基转移酶（RCMT）家族，已被鉴定为拟南芥中的m5CmRNA甲基转移酶。拟南芥RCMT家族成员的序列比对表明，除少数相同的外，序列总体上保守性差，特别是在5'和3'端。当前，唯一已知的m5C结合蛋白是在人类细胞中鉴定出的mRNA输出相关的结合蛋白ALYREF。植物基因组编码多个ALYREF同源物，这些蛋白质是否具有m5CReader的功能是进一步研究的目标。在拟南芥中m5CmRNA修饰的生物学功能研究表明，m5C影响拟南芥的根发育。
7 植物m6A在胚胎发育中，干细胞中，毛状体和叶片形态学中，水稻孢子以及番茄果实成熟中修饰mRNA的生物学功能
在哺乳动物中m6AWriter复合物核心组件的功能丧失会导致胚胎致死，而在植物中也有同样的情况。表明m6A对于胚胎发育至关重要，尽管已研究数年但详细机制仍未探索清楚，这是因为难以获得纯合的突变体材料。原位杂交分析表明，在fip37中，WUSCHEL（WUS）和SHOOT MERISTEMLESS（STM）这两个关键的SAM调节因子的空间表达得到增加。进一步进行了m6A-seq的检测，m6A的甲基化发生了巨大的变化，包括终止密码子附近的m6A位点的丢失，随后降低了这些转录本的mRNA衰减率。因此，m6A可以介导WUS和STM mRNA的稳定性，从而影响芽干细胞。相关研究发现，YTH蛋白ECT2，ECT3和ECT4在拟南芥中是m6A的Reader，是毛状体和叶片发育所必需的。ECT2参与了mRNA的稳定性，并与m6A修饰的毛状体发育相关基因结合，说明m6A通过富集Reader蛋白来介导毛状体和叶片发育的机制。最近，还在水稻中探索了m6A功能。编码m6A甲基转移酶复合物的成员OsFIP或OsMTA2的敲除导致穗长度，受精性和有效种子数减少。OsFIP在孢子发生中具有独特的功能，这些转录本上的m6A缺失加上其基因表达的增加可能导致植物中小孢子的早期退化。用番茄产生了带有过早终止密码子的slalkbh2突变体。与野生型植物相比，在slalkbh2中发现延迟成熟表型及m6A比例显着增加，其导致m6A去甲基化并降解。
8 m6A和m5C在环境信号响应中的作用
在植物中，m6A和m5C对环境变化敏感。在拟南芥中，在高温或干旱胁迫下，m5C水平显着下降，但在几种植物激素处理下（包括生长素，细胞分裂素和脱落酸（ABA）），m5C水平升高。这表明，m6A和m5C可能在植物对环境胁迫的响应过程中发挥作用，这值得进一步研究。
植物mRNA修饰的分子功能
在植物中，一些研究表明，m6A和m5C影响RNA稳定性。在整个转录组中，m6A和mRNA的水平之间存在显着的负相关，并且在植物中失去m6A后，许多转录物的丰度增加，这提出了m6A如何调节不同植物物种和特定环境下基因表达的问题。在哺乳动物中，m6A调节选择性多聚腺苷酸化（APA），最近在植物中也发现了这种作用。这表明，m6A在RNA代谢中的功能在进化过程中可能有所不同。尽管m6A通过Reader蛋白促进其翻译，但m6A在一些植物中似乎有不同的功能。同样，m5C与拟南芥中低效率的mRNA翻译有关。m5C促进了人类中mRNA的运输，这意味着在人类和植物之间可能保留了m5C在调节mRNA运输中的某些功能。
1 真核生物中6mA DNA甲基化的检测
与检测mRNA修饰类似，可通过基于6mA抗体的LC-MS/MS检测6mA DNA甲基化。用于检测全基因组6mA的最常见方法是6mA免疫沉淀，其次是HTS（6mA-IP-seq）（图6）。
图6 显示6mA DNA甲基化检测和作图方法
2 植物中的6mA DNA甲基化动态分析和基因组分布
6mA是植物中的动态标记，广泛分布在拟南芥和水稻中。这在拟南芥和水稻的不同组织和发育阶段的不同水平上也得到了证明，而且该标记对环境变化（例如冷，热和盐胁迫）也非常敏感。
3 6mA DNA 的Writer和Eraser
在真核生物中，已鉴定出四种6mA甲基转移酶，包括秀丽隐杆线虫中的DAMT-1，人的N6-腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1（N6AMT1），四膜虫的脱氧腺苷甲基转移酶1（TAMT-1）和纤毛虫中的MTA1c。DAMT-1，TAMT-1和MTA1c属于MT-A70家族，其中MTA和MTB是植物中RNA 6mA Writer复合物的关键成分（图3A）。而其在植物中是否参与6mA DNA修饰是一个待解决问题。还鉴定了几种6mA脱甲基酶，包括秀丽隐杆线虫中的NMAD-1，果蝇中的DNA 6mA脱甲基酶（DMAD），以及人，小鼠和水稻中的ALKBH1（图7）。TET蛋白，在哺乳动物中可以使DNA脱甲基，但是尚未在植物中鉴定出TET蛋白，这表明植物中缺少某些哺乳动物存在的6mA脱甲基机制。
图7 6mA DNA甲基化及其在植物中的功能。
4 6mA DNA甲基化在植物中的功能
在植物中6mA与基因表达的相关性表现出保守性。在拟南芥发育过程中，从9天龄到21天龄拟南芥获得6mA与转录表达的增加显着相关，而缺少DNA甲基化1（DDM1）突变体的水稻中6mA的丢失导致转录表达明显下降。
5 6mA与生长发育，环境信号响应相关
敲除6mA脱甲基酶ALKBH1使水稻的6mA水平升高和提早抽穗，表明水稻生殖发育需要6mA。此外，植物中的DDM1影响5mC DNA甲基化。最近的发现表明6mA可能响应植物中的环境信号而介导基因表达。在水稻中，6mA的响应热，冷和盐胁迫表现出动态变化。
结论与展望
目前，仅在植物中检测到m6A，m5C和ᴪ的 mRNA修饰。其它mRNA修饰，例如m1A，hm5C，Nm，I和ac4C在哺乳动物中具有重要功能，但在植物中仍未鉴定或检测到。用于定位植物中m6A或m5C的方法，包括miCLIP和m6A-CLIP ，从这些方法获得的单核苷酸数据集将有助于测试特定修饰位点的生物学功能。尽管已经在拟南芥中鉴定了几种m6A的Writer， Eraser， Reader，但尚未在植物中建立用于响应环境变化而动态变化和移除m6A的清晰分子模型。此外，考虑到哺乳动物中的Writer复合体包括其它成员，可能存在m6A甲基转移酶复合体的其它成分在植物中有待发现。然而，在植物中，关于这些蛋白质调控的信息还很少，而且这些成分之间的关系在很大程度上尚不清楚。同时，植物基因组编码多个拷贝的基因，它们含有ALKBH和YTH结构域的基因蛋白质，并且这些蛋白质中只有少数已被鉴定。因此，关键问题是这些其它蛋白是否直接参与m6A脱甲基或与m6A结合。还需要进一步的实验来检测这些蛋白质在植物发育过程中是功能上冗余的还是具有特定功能的。而在哺乳动物中m6A几乎参与了RNA代谢的所有方面，但在植物中仅报道了RNA稳定性，RNA转运，3'UTR加工和潜在的mRNA翻译效应。由于甲基化过程中关键成分的进化保守性，植物mRNA修饰相关机制有待研究。对于6mA DNA甲基化在植物中的表观遗传学作用研究处于早期阶段，许多特异性调节剂和机制尚不清楚。目前单细胞和单分子技术的最新进展有利于进一步了解在单个细胞中基因调控和mRNA/DNA修饰的功能。通过未来植物中合成表观遗传调控的工程将增进我们对mRNA/DNA修饰的功能和机制的理解，也有助于植物育种和人类健康的发展。
评论
早期RNA的化学修饰主要哺乳动物中进行研究，随着HTS发展在植物中mRNA修饰已得到相应的挖掘与验证。本文对定位植物中m6A或m5C的方法进行介绍，并介绍了几种m6A和m5C的Writer， Eraser， Reader，但它们在植物中响应环境变化而动态变化机制与机理尚不清晰。虽然已对其有一个初步研究，包括RNA稳定性，RNA转运，3'UTR加工和潜在的mRNA翻译效应等。但这中间存在很多蛋白互作机制尚不清楚，这为将来的研究提供了一定方向。同时研究者可以通过植物中合成表观遗传调控的工程来增进我们对mRNA/DNA修饰的功能和机制的理解，这也有助于植物育种。
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