科研 |Gut：肝脏转录组学强调IL32是NAFLD相关的新型细胞因子和生物标记物
编译：思越，编辑：景行、江舜尧。
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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是发展成肝硬化/肝癌的重要致病因素，但是目前对其发病机制认知较少，且缺乏准确的非侵入性生物标志物。本文通过对125位NAFLD患者样本进行转录组学分析，发现炎症和脂质代谢途径的上调，并找到了新型NAFLD标志物---IL32，可以通过血液生化学检查诊断NAFLD，并通过建立IL32与ALT-AST的联合模型提高了对NAFLD的预测能力，具有重要的临床价值。
论文ID
原名：Liver transcriptomics highlights interleukin-32 as novel NAFLD-related cytokine and candidate biomarker
译名：肝脏转录组学强调IL32是NAFLD相关的新型细胞因子和生物标记物
期刊：Gut
IF：19.819
发表时间：2020年10月
通讯作者：Stefano Romeo & Luca Valenti
通讯作者单位：米兰大学&卡坦扎罗大学
DOI号：10.1136/gutjnl-2019-319226
结果
已有研究显示，PNPLA3 I148M是肝脏脂质堆积和进行性NAFLD的主要遗传因素，但是由PNPLA3 I148M介导的转录本变异的详细特征仍未被阐明。研究者利用125位重度肥胖患者的肝脏样本进行RNA测序，使用主成分分析去鉴别影响肥胖患者转录本变异的主要因素（图1A）。主成分1（PC1）主要与气球样变、小叶炎症和性别独立相关，并与携带PNPLA3 I148M突变相关；主成分2（PC2）同样与携带PNPLA3 I148M突变及性别相关，提示PNPLA3 I148M可能是肥胖患者转录本变异的主要决定因素。
2 PNPLA3 I148M介导基因的差异表达
为了探究PNPLA3 I148M对患者肝脏转录本的影响，研究者对存在PNPLA3 I148M变异的患者的转录本进行差异表达分析，得到161个下调基因和481个上调基因（表2），通过基因集富集分析（GSEA）显示，这些基因主要与脂质代谢、炎症、癌症相关通路有关。但在非PNPLA3 I148M变异患者中，未发现这些通路的富集，这与先前的研究发现PNPLA3 I148M变异的患者脂质代谢减少，肝脏炎症和细胞增殖的增加是一致的。
3 与重度NAFLD相关的通路与差异基因
研究者进一步分析了重度NAFLD、非重度NAFLD与正常肝脏之间的差异表达基因。在重度NAFLD中，共有320个基因差异表达，并发现与肝纤维化相关的基因Krt8，COL1A1高表达（表2），其中，IL32、SOCS1和AKR1B10的上调最为明显。GSEA显示这些基因主要与炎症、纤维形成、细胞死亡、代谢、缺氧和上皮向间充质转化有关（图1C）。
接着，通过PNPLA3 I148M是否变异对重度NAFLD进行分层。在PNPLA3 I148M变异和非变异的重度NAFLD患者中，共检测到193和148个差异表达基因，其中在两类患者中均发现IL32的上调，非变异患者的主要富集于炎症，上皮向间充质转化，纤维化和缺氧通路上（图1D），变异患者的差异基因主要富集在与炎症相关的IL6-JAK-STAT3信号通路、 KRAS 信号通路、缺氧和凋亡相关的通路上（图1E）。总之，这些结果提示在严重NAFLD中，PNPLA3 I148M的变异可能影响NAFLD向肝硬化乃至肝癌的发展，且IL32的上调是普遍且显著的。
图1.主成分相关性分析与差异通路表达。（A）肝脏转录组主成分（PC）与临床特征的相关性矩阵；（B-E）PNPLA3 I148M变异与非变异、重度NAFLD与轻度NAFLD以及健康个体、重度与轻度PNPLA3 I148M非变异及健康个体、重度与轻度PNPLA3 I148M变异及健康个体的基因富集分析。
4 IL32与重度NAFLD的炎症和代谢反应有关
研究者对于IL32亚型的表达谱进行进一步分析。发现IL32β是IL32家族中表达最多的亚型（图2A），并且相比于非重度NAFLD，在重度NAFLD中IL32β的表达更高（图2B）。为了研究与IL32表达相关的转录模式，研究进行了共表达分析，发现IL32与肝脏损伤修复、炎症、细胞增殖、纤维化、代谢等通路相关，CCL14与IL32呈较强负相关，GSEA分析显示IL32与炎症、肝损伤和新陈代谢相关的途径相关(图3A)。相比与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）组，肝组织中IL32表达升高，且IL32的表达与脂肪变性程度(图3B)、小叶炎症(图3C)、气球样变(图3D)和纤维化(图3E)有关，强调IL32在NAFLD进程中发挥了重要作用。
接着研究者研究了IL32在不同细胞类型中的表达情况（图4A）。相比于肝星状细胞和单核/巨噬细胞，原代肝细胞和HepG2肝癌细胞中的IL32水平更高，且在淋巴细胞和内皮细胞中高表达。此外，通过CHIP实验发现，PPARGC1A和RXRA等几种脂肪酸敏感的转录因子在人体IL32的启动子中有结合位点，说明IL32的表达可能受到肝细胞中脂肪酸和维甲酸的调节，并发现HepG2肝癌细胞中暴露于游离脂肪酸后，IL32表达量呈剂量依赖性增加。
图2.IL32亚型表达谱。（A）IL32基因亚型的百分比；（B）IL32基因亚型绝对表达值。
图3.IL32表达相关性。（A）IL32相关基因通路富集；（B-E） IL32表达按脂肪变性程度、小叶炎症、气球样变和纤维化分层。
5 血浆中可检测到IL32与NAFLD严重程度相关
为进一步明确IL32的临床诊断价值，血浆中的 IL32水平是否反映了其在肝脏的表达。通过对患者血浆中的IL32水平进行分析，发现血浆中的IL32水平与肝脏中IL32的表达具有很强的相关性（图4B）。NAFLD患者中相比于正常人的IL32水平升高（图4C），重度NAFLD患者的IL32水平也高于轻度NAFLD患者（图4D）。在肝病服务机构的另一队列以及合并队列中进行了同样的测试，发现具有相同的现象（图4E，F，G，H）。
接着，研究者将IL32与ALT-AST模型联合进行诊断，以探究IL32是否提高了ALT-AST对于轻度和重度NAFLD的诊断性能。对于诊断NAFLD，在减重手术组中，联合IL32与ALT-AST模型提高了对NAFLD诊断的准确性（AUC=0.85，图5A）；在肝病服务队列中，联合模型也显示出更好的NAFLD的诊断效能（AUC=0.95，图5B），在合并队列中也具有更好的诊断效果（AUC=0.92，图5C）。对于诊断重度NAFLD患者，在减重手术组中，联合IL32与ALT-AST模型部分提高了对NAFLD诊断的准确性，但无统计学意义（图5D）；在肝病服务队列和合并队列中，联合模型并未改善重度NAFLD诊断的准确性（图5E，F）。
图4.不同细胞类型及血浆中IL32的表达。（A）IL32在不同细胞类型中的表达；（B）IL32的肝脏表达与血浆水平之间的Spearman相关性；（C-H）肥胖手术组（C、D），肝病服务队列（E和F）和合并队列中的IL32血浆水平。
图5.IL32诊断准确性。（A-C）减肥手术组（A），肝病服务组（B）和合并队列（C）的NAFLD诊断准确性；（D-F）减肥手术组（A），肝病服务组（B）和合并队列（C）的重度NAFLD诊断准确性。
结论
本研究在前人研究的基础上，明确了PNPLA3I148M在肝脏脂肪变性以及NAFLD进展中的重要作用，为今后NAFLD的基因诊断提供了参考价值；其次，筛选出非重度和重度NAFLD患者差异表达的基因，最终明确IL32在NAFLD发生发展中的重要作用。值得一提的是，IL32在血浆中的表达水平与其在肝脏中的表达水平呈正相关，根据患者血浆IL32水平可以对NAFLD及其严重程度做出诊断，对于改良目前以侵入性检查为主的NAFLD临床诊断有重要参考价值。
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