编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
单细胞测序（SCS）影响了许多癌症研究领域，并提高了研究人员对肿瘤内异质性、肿瘤微环境、转移和治疗耐药性的理解。SCS技术的发展和完善使成本大幅降低，细胞通量增加，重现性提高，为临床应用铺平了道路。然而，在实现转化应用之前，必须克服一些技术挑战。本综述讨论了过去的癌症研究、新兴技术以及未来的临床应用，这些都将改变癌症医学。
原名：Advancing Cancer Research and Medicine with Single-Cell Genomics
译名：单细胞基因组学推进癌症和医学研究
期刊：Cancer Cell
IF：26.602
发表时间：2020.04
通讯作者：Nicholas Navin
通讯作者单位：美国麻省理工大学安德森癌症中心
DOI号：10.1016/j.ccell.2020.03.008
1 当前和新兴的技术
近年来SCS的商业化为肿瘤研究和临床应用提供了稳定的平台（表1）。微液滴系统已成为高通量scRNA-seq（例如10x Genomics）应用最广泛的平台，能够在一次实验中分析多达10000个细胞。然而，其他的研究平台，如纳米孔、组合索引和高通量荧光激活细胞分选（FACS）可提供额外功能，包括细胞成像、细胞选择、降低成本以及多步化学反应。例如，为了在单个细胞中进行全长mRNA分析，可以使用基于FACS的smart-seq2或基于纳米孔的平台来研究选择性剪接。其他平台，如组合索引（sci-RNA-seq）可以实现非常高的扩展性（数百万个细胞），用于检测稀有细胞亚群，例如循环肿瘤细胞（CTC）、癌症干细胞等。总的来说，scRNA-seq方法代表了最成熟的SCS方法。然而，它们仍然存在一些技术限制，包括低表达基因的转录缺失、细胞总基因计数较低和3’端覆盖率的偏好。对于表观遗传学分析，单细胞ATAC测序（scATAC-seq）是最广泛使用的检测单个细胞染色质可及性的方法。在scATAC-seq技术的早期研究中，使用流式细胞仪和标记化学或微流控平台（如Fluidgm）在低细胞通量（96个细胞）下进行实验。然而，scATAC-seq（10x Genomics）微液滴平台的开发，使其成为在单个实验中分析超过10K个细胞的最受欢迎的平台。组合索引（dscATAC-seq）也采用了scATAC-seq方法，实现非常高的扩展性，以较低的成本对数十万个细胞进行分析。与scRNA-seq相比，scATAC-seq的一个主要优点是它可以提供对基因调控和转录或其他因子的更深入的了解，以及提供关于细胞谱系和特征的更多信息。然而scATAC-seq方法仍然受到技术的限制，包括数据少和对组织分离高度敏感。另一种方法是使用单细胞亚硫酸氢盐测序（scBS-seq）和单细胞还原亚硫酸氢盐测序（scRRBS）等方法测量单个细胞中DNA的胞嘧啶甲基化。虽然单细胞DNA甲基化对于表观基因组分析和谱系追踪是非常理想的，但是目前的方法仍然面临着技术问题的挑战，包括细胞通量低和基因组覆盖率低。因此，这些单细胞表观遗传的方法对于分析单个癌细胞仍然是不成熟的。
表1 高通量单细胞测序技术
对于高通量scDNA-seq，使用微滴系统开发了几个商业平台（10x Genomics，Mission Bio）。此外，还开发了许多研究平台，包括高密度FACS分析、微流控平台、纳米孔系统和组合索引法等，并提供了更高的扩展性，支持细胞选择，成本更低，并为定制化学步骤提供更大的灵活性。目前，scDNA-seq最常见的应用是拷贝数变异（CNA）分析。尽管高通量系统，如微滴（10x Genomics）和组合索引可以实现非常高的通量（高达10K个细胞）用于单细胞CNA分析，但它们面临着数据质量较低和基因组分辨率有限的挑战。相比之下，利用标记化学的纳米孔、FACS和微流控平台可以以单分子分辨率提供非常高质量的拷贝数数据，但具有适度的通量（数百到1000个细胞）。scDNA-seq的另一个主要应用是突变检测，它需要对突变位点进行更高的深度覆盖。虽然最初的研究使用WGA的方法对单个细胞进行全基因组或外显子组测序，但由于成本高昂，这些研究仅限于对少数细胞进行分析。为了降低成本和提高通量，后续的研究方法将重点放在对基因组的目标区域进行测序，例如癌症基因组合，来增加深度并降低成本。为了进一步将scDNA-seq扩大到10K以上的细胞进行突变检测，研究人员开发了一种两步微滴法（Mission Bio），该方法对数百个目标基因组区域的单个细胞进行PCR扩增分析。这种高度针对的方法是理想的临床应用，但在发现和推断癌症演变的研究中应用有限。必须克服的技术限制包括突变分析的高等位基因丢失率（10%-20%）、无偏检测的高假阳性以及覆盖深度不均匀。一些新兴技术即将出现，并有可能改变SCS的领域。多组学SCS方法旨在从同一个单细胞（如DNA和RNA、RNA和ATAC）或所有三层的多个分子信息整合起来。这些方法可以为基因型-表型关系和表观基因组学调控基因表达提供更深入的见解。虽然最初的技术已经证明在同一细胞中对DNA和RNA进行测序的技术可行性，但它们目前的通量低、成本高。使用纳米孔系统、微液滴平台和组合索引，这些方法的未来发展有望克服许多这些技术障碍，这可能导致它们在不久的将来广泛应用于癌症研究。
另一种新兴技术是空间分辨的SCS。标准SCS方法的一个主要局限性是它们需要预先制作细胞悬液，因此在分离过程中丢失了细胞在其固有组织环境中位置的所有空间信息。为了保存空间信息，激光捕获显微切割（LCM）可与scDNA-seq或scRNA-seq相结合。但是LCM方法处理的细胞量较低（<100个细胞）。其他方法，如空间转录组微阵列和Slide-Seq是高通量的，可以在数千个空间位置对一小部分细胞测序（10-100个细胞），但没有单细胞的分辨率。相比之下，原位测序技术，包括FISSEQ、MERFISH和seqFISH具有单细胞分辨率，但只能对有限的空间区域成像，并且受限于较小的目标基因。这些空间技术的进一步发展将极大地提高我们对癌症生物学的理解，并有望通过将组织的定性和形态学特征与单细胞分辨率的基因组数据联系起来，彻底改变临床病理学。
2 癌症研究
迄今为止，使用SCS发表的癌症研究大致可分为五个主要领域：（1）癌前病变的侵袭；（2）原发肿瘤的克隆进化和瘤内异质性（ITH）；（3）肿瘤微环境的重组；（4）转移性扩散；（5）治疗性耐药（图1A）。在这些研究中，scRNA-seq和scATAC-seq方法通常被用来解析肿瘤微环境（TME）中的细胞类型和细胞状态，以及肿瘤细胞的表达模式和亚型。对TME中细胞状态的分析可以揭示不同的基质细胞和免疫细胞是如何被重新编程的，反映促进或抑制肿瘤生长的不同生物学功能（图1B）。同样，scRNA-seq方法可以通过分析增殖、干细胞性、缺氧、上皮-间充质转换（EMT）、代谢和其他癌症标志的基因特征，深入了解肿瘤细胞的表型多样性。scRNA-seq相对于普通RNA-seq的一个优点是能够进行细胞类型特异性差异表达分析，以确定TME中的细胞类型是否在治疗或进展等条件下表达不同的基因。其他分析可能包括重建分化谱系或以单细胞分辨率识别肿瘤表达亚型（如PAM50）（图1B）。一些研究小组表明，通过推断DNA拷贝数信息来区分非整倍体肿瘤细胞和TME，并且突变位点（例如外显子组测序）可用于单细胞全长mRNA数据基因分型。然而，这些数据非常稀少，RNA数据中检测到的CNA通常与DNA数据不相关，因此RNA拷贝数方法的最佳应用是从正常细胞中对肿瘤细胞进行分类，而不是推断肿瘤克隆亚结构。scDNA-seq方法可用于在癌前疾病、转移和治疗耐药的情况下，在肿瘤演化过程中解析克隆亚结构并重建克隆谱系（图1C）。scDNA-seq的方法特别有助于解决不同肿瘤克隆中的突变共现和相互排斥性问题。研究人员讨论了癌症研究的几个领域中SCS方法用于阐明癌症生物学。
图1 癌症研究应用与分析
癌前疾病的见解
一个主要的问题是癌前肿瘤如何发展为侵袭性恶性肿瘤。两项使用scDNA-seq的研究集中了解了最常见的癌前乳腺癌的问题，即导管原位癌（DCIS）。通过开发一种称为地形单细胞测序（TSCS）的空间分辨率的scDNA-seq分析方法，基因组CNA与10例同步DCIS-IDC组织的空间信息相关联，表明多个克隆从导管进入侵袭区域。在一项针对四名DCIS-IDC患者的小型研究中，scDNA-seq数据显示原位肿瘤细胞在侵袭过程中经历了群体瓶颈，导致选定基因型的扩展。虽然这两项研究都显示了从DCIS到IDC区域的直接基因组谱系，但他们报告了在入侵期间克隆基因型选择的不同结果。在Barrett食管癌和早期胃癌中，两项研究使用scRNA-seq识别与进展相关的癌前肿瘤细胞中的标记基因。在另一项研究中，scRNA-seq用于比较癌前和晚期胰腺癌之间的TME，显示在进展过程中促炎性免疫细胞的丢失和重组肌成纤维细胞的增加。这些研究强调了利用SCS了解癌前病变向侵袭性疾病进展的实用性，在这种情况下，肿瘤细胞通常是很少见的群体，无法用普通基因组学方法进行分析。
解析肿瘤微环境
TME主要分为免疫细胞组分和基质细胞组分，这两种细胞组分都可以用scRNA-seq和scATAC-seq方法解析。在基质TME中，成纤维细胞一直是一种备受关注的细胞类型，因为它们通常被重新编程为癌相关成纤维细胞（CAF），已证明与肿瘤细胞相互作用并促进或抑制肿瘤生长。在一些癌症中，scRNA研究揭示了基质构建、血管生成和免疫调节中具有不同功能的异质CAF亚型。另一种基质细胞类型是内皮细胞，可重新编程为肿瘤内皮细胞（TEC），通过招募血管系统和调节免疫细胞来促进肿瘤进展。scRNA-seq的方法可以解析内皮细胞的亚型并揭示针对的信号通路。由于免疫疗法在癌症治疗中的应用日益广泛，免疫性颞下颌关节炎是实体瘤研究的另一个热点领域。一些研究使用scRNA-seq研究T细胞，并显示抑制性免疫微环境与不良预后相关，其中T细胞衰竭特征的增加和T细胞活化的减少与多种人类癌症的进展相关。此外，scRNA-seq方法表明组织驻留记忆T细胞在乳腺肿瘤中具有更高的细胞毒性，并与三阴性乳腺癌（TNBC）患者的更好预后相关。髓样细胞是TME的另一个组成部分，与多种癌症类型的患者预后相关。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）传统上被分类为M1（炎症）或M2（促肿瘤）亚型；然而，scRNA-seq数据显示，存在一个连续的巨噬细胞表达程序细胞群，具有大量的细胞状态多样性。scRNA-seq鉴定的其他髓系亚型包括髓源性抑制细胞和单核细胞。值得注意的是，两项使用scRNA-seq的胶质瘤研究表明，TME中与小胶质细胞相关的外周巨噬细胞表达程序增加与胶质瘤患者的进展和生存率差有关。
肿瘤细胞表型的多样性
肿瘤细胞在增殖、干细胞性、EMT、侵袭、迁移、代谢、免疫逃避、凋亡和缺氧等方面表现出不同的表型。这种多样性可能在进展、治疗反应、侵袭和转移中起重要作用。与普通基因组方法相比，scRNA-seq和scATAC-seq具有解决肿瘤细胞表型多样性和可塑性的能力。在胶质母细胞瘤（GBM）中，scRNA-seq鉴定了EMT和干细胞性信号的可塑性，表明大多数肿瘤由具有不同GBM亚型特征的细胞组成。类似地，在TNBC的snRNA-seq中，虽然基底样细胞（PAM50）表达亚型通常占主导地位，但在肿瘤中也有许多癌细胞与其他表达特征细胞共存，这些细胞对化疗没有反应。头和颈部肿瘤的scRNA-seq也发现了EMT状态的变化，其中部分EMT与侵袭和转移扩散相关。在乳腺癌中，scRNA-seq鉴定了不同患者的EMT、血管生成和干细胞性的表型变异。在TNBC中，scRNA-seq分析确定了与治疗耐药和转移相关的鞘糖脂代谢特征，并预测了患者的预后。scRNA-seq等方法也可用于推断人类肿瘤的细胞层次、谱系可塑性和发育轨迹。在脑肿瘤中使用scRNA-seq方法可以深入了解早期胶质瘤（星形胶质细胞、少突胶质细胞）中肿瘤细胞的分化轨迹，以及侵袭性GBM状态之间的动态可塑性。通过对GBM肿瘤进行空间采样，另一项scRNA-seq研究显示，与内核相比，肿瘤边缘附近侵袭性肿瘤细胞显示出缺氧、低增殖和低粘附性。单细胞多组学研究也揭示了基因突变和转录重编程之间的联系。通过转录组基因分型，研究人员通过比较野生型和突变，确定CALR突变骨髓增生性肿瘤的未折叠蛋白。另一项针对结直肠癌原发性和转移性配对样本的研究使用单细胞“三组分”（DNA、RNA、甲基化）表明，DNA甲基化水平在不同的遗传谱系中存在差异，但在转移过程中相对稳定。
克隆演化
在原发性肿瘤的增殖过程中，肿瘤细胞经过达尔文进化，在选择性压力下形成不同的克隆谱系。与scDNA-seq方法相比，普通测序在解决肿瘤中的ITH和克隆谱系方面的能力有限。这些数据可以深入了解肿瘤演化的一般模型。scDNA- seq发现的一个进化模型是乳腺癌中的断续拷贝数进化，它表明基因组不稳定性的早期爆发会导致数百个基因组位点重排，这些重排会重新稳定并经历稳定的克隆增殖，挑战了渐进进化的模式。在乳腺癌、异种移植和卵巢癌中使用单细胞拷贝数分析的研究也表明，CNA在单个肿瘤细胞中高度稳定。与拷贝数数据相比， scDNA-seq得到的突变数据可以支持分支进化研究，因为它表明突变发生得更为缓慢，并且多个谱系和克隆通常在同一时间点共存于肿瘤中。scDNA-seq数据的方法可以用来识别克隆中驱动突变的组合和相互排斥性，为临床干预提供指导。例如，在儿童急性淋巴细胞白血病中，靶向scDNA-seq鉴定出与增殖有关的晚期癌基因突变，这些突变可以靶向治疗该病。在急性髓系白血病（AML）中，微滴scDNA-seq分析发现了在用FLT3抑制剂治疗后出现的NRAS、KRAS和FLT3的同时突变，为治疗提供了额外的靶点。通过应用scDNA-seq和scRNA-seq，一项关于慢性淋巴细胞白血病（CLL）的研究发现了LCP1和WNK1的驱动突变，并表明不同的遗传谱系可以采用类似的表达程序。另一项CLL研究应用scRRBS-seq和scRNA-seq重建B细胞系，并显示在ibrutinib治疗后，B细胞的特定谱系显示Toll样受体通路上调。
肿瘤转移与CTC测序分析
肿瘤转移与癌症患者的发病率和死亡率高度相关。在转移方面的知识缺口包括：原发肿瘤中的哪些克隆能够传播，癌细胞向远处器官部位扩散的次数，以及TME是否在转移生态位中起作用。SCS方法可以解决原发性和转移性肿瘤中的ITH和TME，以及关键的中间产物CTC，为深入研究这些问题提供了思路。在原发性结直肠癌和肝转移瘤中，两名患者的scDNA-seq发现了一种向肝脏的晚期传播的模型。在一例乳腺癌患者衍生的异种移植（PDX）中，scRNA-seq鉴定出在疾病中启动转移和MYC表达的干细胞样细胞。另一项肾细胞癌的PDX研究使用scRNA-seq识别转移特征，包括EGFR、Scr和BRAF/MEK等提供潜在治疗靶点的基因。在人类头颈癌中，肿瘤细胞的scRNA-seq鉴定了侵袭性表达程序，包括细胞周期、应激、缺氧、分化和部分EMT程序，这些程序促进了转移。SCS方法也被用于分析肿瘤转移中CTC的基因组和转录组。使用scDNA-seq的研究发现，与原发性和转移性肿瘤相比，CTC中的突变和CNA高度一致。在人类血液样本中，CTC和CTC细胞簇的转录组的scRNA-seq也识别了与传播有关的基因。在胰腺癌中，scRNA-seq鉴定出低增殖、富含干细胞基因和基质来源的细胞外基质基因的转移特征。在乳腺癌中，CTC的scRNA-seq确认plakoglobin是CTC细胞簇形成中的一个关键细胞连接基因，可以提高传播效率。scRNA-seq鉴定的CTC基因表达特征与肺癌、乳腺癌和前列腺癌的治疗反应和转移风险相关，为临床应用铺平了道路。
治疗性耐药
耐药性是人类癌症治疗的主要障碍。虽然化疗、激素治疗、靶向治疗和免疫治疗等治疗通常最初是有效的，但许多患者对肿瘤转移产生了抵抗。研究的关键领域包括了解耐药性的机制、识别反应的预测性生物标志物以及阐明耐药疾病的演变。SCS方法可以从具有临床结果数据的治疗前样本或治疗前后收集的纵向时间点样本来研究ITH和TME。一些研究已经应用scRNA-seq来识别组织样本和CTC的治疗反应和耐药性的特征。在ER+/HER2乳腺癌中，scRNA-seq分析发现化疗期间CTC中HER2信号的差异与耐药性相关。在前列腺癌中，CTC的scRNA-seq分析确定了雄激素受体抑制剂抵抗中激活的非典型Wnt信号。用药物处理过的细胞系和用scRNA-seq分析的细胞系也提供了对耐药性的见解。在内分泌抵抗性乳腺癌中，使用scRNA-seq分析的细胞系显示，KDM5抑制剂耐药性是由于获得的表观遗传状态，在抗雌激素的ER+细胞中高表达KDM5和ITH。在另一项乳腺癌研究中，scRNA-seq在接受化疗的细胞系中发现，用BRAF抑制剂治疗的黑色素瘤细胞系中，EMT和干细胞性的基因上调，细胞周期基因下调，发现了一种罕见的预耐药细胞状态，这需要进一步的表观遗传重编程和SOX10的失活来达到完全抗性的状态。在其他接受化疗治疗的口腔癌细胞系研究中，scRNA-seq分析表明，表型异质性有利于选择已有的克隆，而同质群体通过增加SOX9表达和SOX2缺失导致表观基因组重编程。为了了解耐药的基因组演变，一些研究使用scDNA-seq方法来了解耐药克隆是否预先存在于肿瘤中，并在治疗后进行选择（适应性耐药），或者是否有治疗诱导的耐药突变（获得性耐药）。在一项针对小细胞肺癌（SCLC）患者的CTC的研究中，对化疗前后血样的分析显示治疗后的CNA图谱一致，表明存在固有或适应性耐药模型。在另一项关于TNBC辅助化疗耐药的研究中，使用scDNA-seq和scRNA-seq的组合分析显示，耐药基因型在肿瘤中预先存在，并进行适应性选择，然后进一步转录重编程以获得完全耐药表型。在耐药前列腺癌中，CTC的scDNA-seq显示，在耐药期间，亚克隆中选择了MYC和AR扩增。在使用FLT3抑制剂治疗的AML患者中，scDNA-seq鉴定出在DNMT3A突变或IDH2、AXSL1和NRA结合后出现的罕见亚克隆。
抗药性疾病的TME重编程也可以用scRNA-seq和scATAC-seq方法进行研究。在黑色素瘤中，scRNA-seq在细胞毒性T细胞群中发现了与治疗反应相关的TCF7+记忆样细胞状态。在基底细胞癌中，scATAC-seq用于分析PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）阻断治疗前后的活检，结果表明，治疗后衰竭的T细胞高度扩张，这表明PD-1阻断可影响TME中的CD4+和CD8+细胞状态。这些研究强调了SCS方法在揭示免疫TME在治疗反应和耐药性中的作用的潜力。
3 临床SCS样品处理流程
从诊所收集和处理SCS的新鲜组织显示独特的后勤和技术挑战。虽然scDNA-seq和scATAC-seq方法可应用于多种生物样本（快速冷冻组织、最佳切割温度（OCT）培养基冷冻样品，甚至福尔马林固定石蜡包埋FFPE），但scRNA- seq等方法需要预先制备活细胞悬浮液（图2A）。问题是组织的快速冷冻（不使用冷冻介质）会导致细胞膜破裂，因此无法为随后的分离和运行scRNA-seq分析提供完整的细胞。幸运的是，在冻融循环中，核膜保持完整，保护了细胞核中的DNA、染色质甚至RNA。这种独特的特性使得研究人员能够从快速冷冻或OCT组织中分离出核悬浮液进行单核测序，包括snDNA-seq、snATAC-seq和snRNA-seq（图2A）。然而，尽管该策略对scDNA分析有效，但核RNA的分析会导致基因计数减少、UMI降低，以及许多基因和通路表达的差异。因此，在大多数研究和临床应用中，scRNA-seq方法是首选的方法，它需要实施一个快速组织分离（RTD）的程序，而目前大多数癌症医院的常规病理学实验室还没有这种方法。为了在短时间内为scRNA-seq获得新鲜的临床组织，必须建立一个RTD计划，其中包括肿瘤医生、外科医生、病理学家和研究人员之间的密切合作（图2B）。在RTD计划中，外科医生必须在一个快速的时间范围内将切除的肿瘤组织交给病理学家，然后病理学家必须确定高纯度的肿瘤区域进行宏观解剖（手术标本），并将组织放入细胞培养基中，理想情况下，在不到1小时的时间内。对于核心活检或细针抽吸（FNA）样本中，这一时间可以大大减少，因为放射科医生可以将样本直接放入培养基管中，并为病理学家提供不同的样。一旦组织浸没在培养基中，研究小组就可以将样本转移回实验室进行分离，产生单细胞悬浮液。理想情况下，癌症医院会建立一个专门的RTD设施，集中处理来自手术或活检程序的组织样本，以产生活细胞悬浮液。然而，RTD面临的一个挑战是，每种组织类型（如乳腺、胰腺、肝脏）都需要不同的解离方案，解离时间、消化酶、红细胞裂解和其他步骤可能不同。幸运的是，诸如人类细胞图谱（HCA）等合作努力正在为许多组织类型开发标准步骤，这些组织类型可在网上获取(www.protocols.io)并帮助研究人员。细胞分离后，必须对细胞活力（理想情况下>70%）和细胞计数（理想情况下>100K细胞总数）进行质量控制。幸运的是，在这一步之后，活细胞可以在冷冻介质中长时间冷冻保存，并分批进行许多scRNA-seq实验。然而，在逻辑上可行的情况下，从新鲜细胞悬浮液中提取样本而不进行冷冻保存会产生最佳的数据质量。另一个可选步骤涉及使用流式细胞仪或抗体柱富集感兴趣细胞（例如CD45）、基质细胞或肿瘤细胞（例如Ep-CAM、细胞角蛋白）。最后的细胞悬液作为SCS方法的研究样本，然后进行二代测序（NGS）。尽管FFPE拥有丰富的临床组织来源信息和长期临床结果信息，但这些材料与标准SCS方法不兼容。主要问题是，当组织置于福尔马林中时，FFPE处理会导致RNA和DNA的断裂和降解。虽然scRNA和scATAC方法在FFPE材料中可能永远不可能，但scDNA-seq方法的发展可能使CNA分析和靶向突变分析在不久的将来成为可能。通过在癌前乳腺癌组织的FFPE组织中添加DNA损伤修复酶进行单细胞CNA分析，初步取得了成功。其他设计用于PCR扩增靶区的策略可能也适用于DNA断裂的FFPE组织。因此，未来scDNA-seq技术的发展可能会为临床病理学中常用的FFPE组织和苏木精-伊红玻片打开大门。
图2 SCS临床组织相容性与处理流程
4 在癌症医学中的应用
尽管迄今为止发表的大多数SCS研究都是以研究为中心，但SCS技术的发展和完善为临床翻译提供了新的机会。希望SCS将改变癌症医学的几个领域，包括早期检测、诊断和风险分层、药物靶向发现、靶向微环境、靶向肿瘤克隆和无创监测（图3A）。这里将讨论这些领域的初步进展以及未来临床意义上的挑战。
早期检测
早期检测在现代肿瘤学中是最重要的，因为它可以干预和降低患者的发病率。然而，早期癌症的发现仍然严重依赖于影像学技术和病理学分析。扩散性肿瘤细胞可通过细胞病理学在许多接近癌源的体液中检测到，例如膀胱癌和前列腺癌的尿液；子宫内膜癌和胰腺癌的卵巢腹膜冲洗液；鼻咽癌的唾液。这些样本为SCS方法评估进展风险提供了一个独特的机会。早期发现对于癌症发展的高危人群尤其重要，包括肿瘤抑制基因突变（如BRCA1和BRCA2突变）、胃酸反流、炎症性肠病和有大量吸烟史的患者。尽管迄今为止，大多数研究都集中在使用影像学方法或病理染色来识别体液中的早期癌细胞，但SCS方法可以提供更丰富的信息，说明这些细胞有可能对患者造成进展。在最初的一项研究中，scRNA-seq被用于研究40名多发性骨髓瘤患者和11名健康对照，确定了一些无症状疾病患者的罕见侵袭性浆细胞的表达程序。期望未来应用scDNA-seq和scRNA-seq结合早期筛查和诊断，将有助于提高早期检测和评估进展为恶性疾病的风险。
改进临床诊断和风险分层
侵袭性癌症的临床诊断很大程度上依赖于组织病理学评估，而这些评估往往存在差异。SCS方法已被证明在DCIS、胰腺癌前病变、前列腺导管内瘤样病变和非典型腺瘤性增生中的癌前细胞进行分析非常有效。在浸润性前列腺癌中，通过组织活检单细胞分析检测到的侵袭性克隆群体与手术Gleason评分有很好的相关性，从而指导基于病理诊断的手术决策。在另一项研究中，SCS的结直肠癌亚型被用于确定个体患者的最佳治疗方案。另一个临床机会涉及未知原发性癌症的诊断，它代表一种没有明确器官来源的侵袭性癌症，其中scRNA-seq和scATAC-seq方法可以提供对初始器官部位的洞察，从而对治疗有意义。风险分层是癌症治疗过程中个性化治疗计划的另一个重要方面，包括（1）诊断时，（2）局部治疗完成后，（3）转移复发时。目前的风险分层工具依赖于组织病理学分析、细胞遗传学标记、种系突变或基因表达组合。然而，使用普通RNA-seq分析和qPCR的预测基因表达组合受到肿瘤、间质和免疫细胞混合物的挑战，这些细胞因患者而异。目前的基因表达组合并不是针对单个患者的精确预测，而是提供基于人群的预测（例如，相同得分的患者组的复发率）。通过scRNA-seq方法从肿瘤细胞或TME中获得纯细胞类型特异性表达信号，从而预测进展、转移或治疗耐药的风险，这些检测方法可能会得到改进。因此，SCS方法有可能改进诊断和风险评估，以确定哪些患者需要更积极的治疗策略。
药物靶点发现
SCS方法发现肿瘤细胞和原发性、转移性或抗治疗性疾病的TME提供了有力的工具。例如，在前列腺癌中，CTC的scRNA-seq分析确定了雄激素受体抑制剂耐药性中激活的非经典Wnt信号，为治疗晚期疾病提供了新的治疗靶点。在乳腺癌中，scRNA-seq鉴定出NOTCH1和HER2在患者来源的CTC中的表达呈负相关，其中HER2阴性CTC对docetaxel的敏感性降低，但对可能用于治疗的Notch抑制剂敏感。在一项临床前研究中，docetaxel敏感和耐药的MCF7乳腺癌细胞株的scRNA-seq鉴定了耐药细胞中上调的EMT和干细胞性的相关基因以及下调的细胞周期基因，为克服耐药性提供了潜在的药物靶点。纵向抽样肿瘤治疗也可以确定耐药克隆的出现和潜在的药物靶点。在耐化疗的TNBC患者中，纵向活检的snRNA-seq识别了EMT、AKT1信号、缺氧、CDH1和血管生成的特征，这些特征可能是治疗耐药疾病的目标。scRNA-seq和scATAC-seq的方法可用于研究TME中的细胞类型，并识别基质中的药物靶点和促进进展、转移或治疗性耐药的免疫细胞类型。在用抗HER2和CDK4/6抑制剂治疗的乳腺癌小鼠模型中，scRNA-seq鉴定了对cabozantinib敏感的Gr1+未成熟髓系细胞的富集，提供了一个新的治疗靶点，并在人类患者中得到验证。在另一项乳腺癌研究中，scRNA-seq揭示了接受内分泌治疗的患者通过转录组重编程和拷贝数变化而产生的一系列适应性变化。因此，希望SCS方法能为TME和肿瘤细胞提供新的药物靶点，从而提高肿瘤患者的治疗水平，从而开创药物开发的新纪元。
靶向肿瘤微环境
TME中重编程的细胞类型，包括CAF、TEC、TAM和肿瘤脂肪细胞，对肿瘤进展、转移或治疗抵抗有显著影响。在研究背景下，scRNA-seq或scATAC-seq方法是研究TME和识别肿瘤中可促进或抑制肿瘤生长或治疗抵抗的重组免疫和基质细胞类型的有力工具。这些数据原则上可用于在临床环境中对异常细胞类型选择靶向治疗（图3B）。例如，含有TAM的肿瘤可以用ANG2/TIE2轴抑制剂（rebastinib）、MIF抑制剂（抗CD74抗体）或他汀类药物来间接调节TAM的功能（辛伐他汀、阿托伐他汀）。重组树突状细胞的肿瘤可以用腺苷A2A和A2B受体双重抑制剂（AB-928）或抗CD73（BMS-986179）治疗。T细胞可以用检查点抑制剂治疗：抗CTLA（ipilimumab）、抗PD1（pembrolizumab、durvalumab）和抗PD配体1（atezolizumab、avelumab）。类似地，具有重组基质细胞类型的肿瘤，如TEC，可以用JAK-STAT（ruxolitinib）和血管内皮生长因子（bevacizumab、cabozantinib）抑制剂治疗。CAF可以用FAP抑制剂（PT-100、sibrotuzumab）或核受体调节剂（MORAb2、WYC-209）治疗。这些SCS工具可以大大提高针对TME中重编程细胞类型的能力，以提高癌症治疗的疗效。
靶向肿瘤细胞
ITH在实体肿瘤中很常见，因此通过普通测序检测到的单个基因靶点可能对肿瘤中的所有克隆都无效。ITH可以用scDNA-seq进行解析，以重建克隆谱系并识别肿瘤谱系中的主干型（在所有肿瘤细胞中）、亚克隆型（在谱系中共享）或私有型（只有一个克隆）的突变。重要的是，scDNA-seq可以揭示肿瘤组织中克隆突变的组合，以识别某些突变在同一肿瘤细胞中是相互排斥的还是同时发生的。肿瘤学家可以利用这些数据来指导治疗决策，靶向突变是主干型的或是亚群的，这些突变可能具有更高的转移、治疗抵抗或进展的风险（图3A）。在急性髓系白血病中，使用微滴系统的高通量scDNA-seq识别了治疗背景下的克隆重构，以确定用于治疗复发性疾病的相关病理克隆。肿瘤细胞的scRNA-seq等方法也可以通过提供肿瘤细胞及其信号通路的表型信息来研究EMT、增殖、迁移和凋亡等过程中的异质性，从而在指导治疗过程发挥作用。因此，SCS方法为解决肿瘤中的克隆亚结构和指导基于突变共现和异常表达程序的治疗决策提供了强有力的工具。
无创监测
迄今为止，SCS方法的最广泛应用是在CTC的基因组分析中，对疾病进展进行无创监测，检测耐药克隆的出现，并跟踪最小疾病残留。与转移性组织活检相比，CTC分析全面监测跨多器官部位的基因组畸变和微转移。此外，这些方法允许纵向测量跟踪肿瘤细胞在疾病进展和治疗过程中的基因组变化，而无需进行侵入性活检。与循环肿瘤DNA方法相比，CTC还可以解决血液中的克隆多样性，并提供RNA基因表达的信息。在前列腺癌中，使用scDNA-seq分析CTC随时间的变化有助于检测CTC的克隆和亚克隆变化，这些变化提供了进展、回归和耐药疾病出现的信息。单时间点样本的CTC也可用于预测治疗反应和临床结果。在一项乳腺癌研究中，CTC的scRNA-seq识别出17个以上的乳腺癌特异性RNA特征，这些特征用于生成评分，以预测临床结果和进展风险。同样，在前列腺癌中，使用与较差整体生存率和早期传播相关的基因特征，确定了转移和局部部位的两个CTC评分。因此，使用SCS方法对CTC进行无创监测和风险预测具有很大的潜力。
图3 单细胞基因组学的临床应用
最后，SCS技术已经改变了癌症研究的许多领域，并准备在临床上产生更大的影响。正如NGS技术在过去十年里改变了现代肿瘤学一样，预计SCS方法将影响癌症医学的许多领域，并将成为癌症医院的常用工具。虽然在医院广泛开展SCS研究的最大障碍可能是RTD项目的实施，但从SCS分析中获得的丰富信息可以证明这些努力的合理性。未来几年，包括空间SCS和多组学方法在内的新兴技术将进一步扩展SCS方法的能力，并将对癌症研究和临床病理学产生重大影响。总的来说，预计在未来十年，SCS在癌症医学中的应用将导致癌症患者诊断和治疗的巨大改善。
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