科研|Nat Comm：解析LncRNA调控肿瘤糖酵解重编程的作用及机制
编译：冬日暖阳，编辑：谢衣、江舜尧。
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快速增殖和葡萄糖代谢重塑是癌症细胞的标志反应之一。为了提供足够的癌细胞快速繁殖的能力，即使在有氧状态下，肿瘤细胞也会优先进行糖酵解，而不是通过产能效率更高的氧化磷酸化途径为细胞生长提供能量，这就是著名的瓦博格效应。表现为葡萄糖摄取率高，糖酵解活跃，代谢产物乳酸含量高。糖酵解消耗更多葡萄糖，但产生的ATP数量比较少。长链非编码RNA（LncRNA）与代谢重编程密切相关。我们最近的研究调查了代谢重编程在促进糖酵解中的作用，磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3（PFKFB3）催化果糖-2,6-双磷酸酯（F-2,6-BP）的生成，这是关键酶6-磷酸果糖激酶1的强变构激活剂。因此，PFKFB3的激活与糖酵解的增强有关。最近的研究揭示了PFKFB3通过调节细胞周期蛋白的表达来促进细胞增殖，表现为细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）被上调，而p27被下调。据报道，抑制PFKFB3表达将是一种有前途的癌症治疗方法，因为它可以抑制癌细胞中的糖酵解、增殖和转移。在这里，我们确定了LncRNA肌动蛋白γ1假基因（AGPG）通过增强PFKFB3稳定性从而在葡萄糖代谢重塑和细胞增殖中起关键作用。
论文ID
原名：Long noncoding RNA AGPG regulates PFKFB3-mediated tumor glycolytic reprogramming
译名：LncRNA调控肿瘤糖酵解重编程的作用及机制
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2020.03
通讯作者：徐瑞华&鞠怀强
作者单位：中山大学附属肿瘤医院
实验设计
实验结果
1 AGPG被鉴定为作为代谢相关的LncRNA
为了发现对ESCC发育有显著影响的致癌LncRNA，我们首先从肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中鉴定出在ESCC组织中表达高于成对相邻正常组织的LncRNA。然后，我们根据log2差异倍数对这些LncRNA进行分类。接下来，我们建立了一个siRNA库，对于siRNA进行筛选，这些siRNAs还包含了TARGETplus上的专有双链化学修饰，以确保最佳的链负载和干扰类似microRNA的种子活性，从而减少非目标效应。为了确定可能改变葡萄糖代谢的LncRNA，我们将siRNA文库转染到两个人ESCC细胞中，检测细胞活力和乳酸生成。我们发现14个LncRNA可能是细胞增殖所必需的，10个参与乳酸的产生，8个可能参与细胞活力和葡萄糖代谢（图1a）。在这8个低分子RNA中，AGPG基因敲除显著降低了细胞活力和乳酸生成（图1b）。生物信息学分析显示，AGPG位于染色体1q32.1上，有3个外显子（1-56、10447-10526和11304-13488）。我们关注的是AC098934.2-201亚型，为了简单起见，我们将该亚型称为AGPG。然后，我们在人食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞（Het-1A和NE-1）中验证了AGPG的表达水平，我们发现肿瘤细胞的AGPG水平明显高于正常细胞，ESCC细胞的AGPG拷贝数也增加（图1c,d），AGPG在其他ESCC细胞系中对细胞增殖和分泌乳酸的作用也得到进一步证实。
图1 AGPG被鉴定为作为代谢相关的LncRNA
2 AGPG的表达与食管鳞癌预后的关系
与我们的生物信息学分析结果（图1e）一致，我们发现高AGPG水平与ESCC患者的不利总体生存率相关（图1f）。与中值相比，我们将基因表达分为低表达或高表达：如果表达水平高于中值，则将其分为高表达，而如果低于中值，则将其分为低表达。多因素分析也表明AGPG是ESCC患者的独立预后因素。根据TCGA数据库分析，AGPG在多种癌症中高表达，包括胃癌（GC）、结直肠癌（CRC）、肝癌、乳腺癌和肺癌。但在多形性胶质母细胞瘤（GBM）、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌等肿瘤组织中，其表达与正常组织无明显差异。此外，在肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中，AGPG水平也降低。与许多其他LncRNA类似，AGPG在不同癌症中具有组织特异性表达模式。接下来，我们进行qRT-PCR和RNAScope原位杂交（ISH）检测AGPG在ESCC、GC和CRC组织中的表达。我们的结果显示AGPG在ESCC、GC和CRC组织中高度表达（图1g-i）。这些结果提示AGPG的失调与癌症的发展有着密切的关系。为了确定AGPG的亚细胞定位，我们用qRT-PCR方法检测了AGPG在胞质和细胞核中的表达。结果表明，AGPG主要定位于细胞核，部分定位于细胞质，RNAScope-ISH和RNA荧光原位杂交进一步证实了这一点（图1j-l，补充图1i）。
3 AGPG促进细胞增殖和糖酵解
由于AGPG可能参与细胞增殖和乳酸生成，我们进一步研究了AGPG在细胞行为中的功能作用。KYSE150和KYSE30细胞中的AGPG敲除显著抑制细胞增殖和菌落形成（图2a-d），AGPG敲除阻断G1/S细胞周期转换（图2e、f）。我们还检测到了关键细胞周期蛋白，并观察到AGPG基因敲除显著增加了p27的表达，降低了CDK1的表达（图2g），但没有改变p21、p53、CDK3或CDK6的表达。这些结果提示，AGPG可能通过调节p27等关键细胞周期蛋白和CDK1介导的G1/S进程来促进细胞增殖。为了验证AGPG在代谢重编程中的作用，使用细胞外流量分析仪测量ESCC细胞的细胞外酸化率（ECAR）（图2h，i），证明AGPG基因敲除显著损害糖酵解，这与我们之前的筛选结果一致。为了进一步确定葡萄糖的代谢流量，我们检测了13C6葡萄糖孵育2 h后，ESCC细胞内13C标记的代谢中间产物的数量（图2j）。基于液相色谱和质谱（MS）的代谢组分析表明，AGPG基因敲除后糖酵解的细胞内代谢物（3-磷酸甘油酸、丙酮酸和乳酸）明显减少，进一步证实AGPG对葡萄糖转化为乳酸至关重要（图2k-m）。为了进一步确认AGPG的功能作用，我们使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统生成了AGPG-CRISPR-KO细胞，结果显示AGPG CRISPR KO显著抑制ESCC细胞增殖和细胞周期进展。综上所述，我们的数据表明，AGPG在调节肿瘤代谢重编程和肿瘤生长方面具有重要的功能。
图2：细胞增殖和代谢重塑需要AGPG
4 AGPG与PFKFB3直接相关
为了剖析AGPG介导的代谢重塑的分子机制，我们尝试通过RNA pull-down分析和质谱分析来鉴定AGPG相关蛋白。通过比较AGPG结合蛋白和反义AGPG结合蛋白，发现非反义对照的sense-AGPG与PFKFB3（图3a）有特异性的相互作用，如前所述，PFKFB3也主要位于细胞核内。通过发现AGPG直接结合到纯化His标记的重组PFKFB3（图3b）进一步证实了这一观察结果。AGPG和PFKFB3之间的相互作用也通过RNA免疫沉淀（RIP）分析得到证实（图3c）。为了进一步研究AGPG和PFKFB3在体内的相互作用，我们进行了MTRAP和western blotting，与阴性对照组相比，MS2-AGPG和MCP-3FLAG质粒的共表达导致PFKFB3显著富集，表明PFKFB3特异性地与AGPG结合（图3d）。免疫荧光共聚焦分析表明，AGPG和PFKFB3主要在细胞核内共聚焦，在细胞质内有部分共聚焦，提示AGPG-PFKFB3复合物可能在细胞核和细胞质中都起作用（图3e）。此外，我们用qPCR检测AGPG的表达，用western blotting检测PFKFB3在一组ESCC细胞、12对ESCC组织和匹配的正常食管组织（SYSUCC）中的表达。如所料，AGPG的表达与ESCC中PFKFB3的表达呈正相关（图3f），这进一步揭示了AGPG与PFKFB3之间的功能关系。总之，这些结果表明AGPG和PFKFB3是密切相关的，它们的相互作用在人类癌症的发展中起着重要作用。
图3 AGPG与PFKFB3直接相关
5 AGPG介导的T5片段与PFKFB3的相互作用
为了定位介导AGPG与PFKFB3相互作用的区域，我们使用体外合成的全长（FL）AGPG和T1（1–800）、T2（801–1140）、T3（1141–1700）、T4（1701–2030）和T5（2031–2321）片段进行RNA pull-down分析，然后通过western blotting分析产物。我们证明了T5片段可以与PFKFB3结合，而其他片段或珠状对照不能结合。用纯化的重组PFKFB3进一步验证了这些结果（图3g）。我们还进行了CLIP qPCR分析证明T5片段是负责结合PFKFB3的主要区域（图3h）。删除T5片段后，AGPG不能再与PFKFB3相互作用（图3i）。AGPG FL的过表达足以防止AGPG敲除后观察到的表型，包括糖酵解性重编程和细胞增殖（图3j，k）。这些结果显示，AGPG与PFKFB3相互作用和调节需要T5片段，而下游细胞过程可能是通过AGPG与PFKFB3相互作用介导的。为了进一步确定与PFKFB3结合的特定基序，我们进行了HITS-CLIP，在这些基序中，CCAGCCA或类似的基序是高度排序的，可以通过多种方法识别。这些数据表明AGPG的CCAGCCA基序对其结合PFKFB3和促进肿瘤糖酵解重编程的能力很重要。
6 AGPG阻断APC/C介导的PFKFB3泛素化
由于PFKFB3含有一个激酶结构域和一个磷酸酶结构域，因此构建了三个含有FL（1-520）、N-末端（N，1-245）和C-末端（C 246-520）结构的带有人类标记的PFKFB3载体，以鉴定与AGPG相关的PFKFB3残基。有趣的是，我们证明AGPG主要与C-末端片段相互作用，与N-末端片段的结合最小（图4a）。然后，我们使用IgG对照进行RIP分析。如所料，AGPG与PFKFB3的C末端片段一起沉淀（图4b）。然后，我们评估了AGPG-PFKFB3相互作用对PFKFB3的功能影响。有趣的是，shRNA介导的AGPG基因敲除显著降低了PFKFB3的表达（图4c），这也被CRISPR/Cas9证实在AGPG-CRISPR-KO细胞中（图4d）。此外，过表达AGPG FL互补了AGPG缺失引起的PFKFB3水平下降（图4d）。这些数据表明AGPG可能通过T5片段调节PFKFB3蛋白水平。并且蛋白酶体抑制剂MG-132恢复了PFKFB3水平的降低（图4e）。PFKFB3包含一个KEN盒，通过后期靶向蛋白质泛素化测试，PFKFB3被证明受到涉及一种细胞周期调节的E3泛素连接酶APC/C-Cdh1的降解。因此，为了进一步阐明AGPG阻断PFKFB3泛素化的机制，我们使用PFKFB3和Cdc27抗体进行coIP分析，以确定AGPG是否影响PFKFB3和活性APC/C之间的相互作用。结果显示AGPG CRISPR KO显著增加了PFKFB3/Cdc27的相互作用（图4h），提示AGPG可阻断Cdc27与PFKFB3的结合。
7 AGPG是p53的转录靶点
由于AGPG在肿瘤中高表达，我们试图确定AGPG的调节机制。通路分析表明AGPG表达与p53呈负相关（图5a）。对不同TP53基因型的细胞的分析表明TP53 KO的HCT-116细胞的AGPG水平高于对照细胞（图5b），具有WT-TP53（KYSE150）的细胞表达的AGPG水平远低于含有突变株（MT）TP53（TE-1和KYSE30）24的细胞（图5c）。KYSE150和HCT-116细胞中WT TP53的过度表达降低了AGPG水平，而TP53的敲除增加了AGPG的表达，进一步证实了p53在调节AGPG表达中的作用（图5d）。此外，通过qPCR分析，AGPG表达水平与WT-TP53的ESCC患者的TP53表达呈负相关（图5e，SYSUCC，n = 72）。接下来，我们确定了p53介导的AGPG调控所需的区域，AGPG启动子包含p53结合序列（图5f），该序列被识别为p53结合区（p53-BR）（图5g）。且含有完整p53-BR（p53-BR-wt）的荧光素酶报告子的转录活性明显弱于那些p53-BR缺失的报告子（p53-BR-mt）。此外，WT-TP53的共转染选择性地降低了具有完整p53-BR的报告者的转录活性（图5h）。总之，我们的数据显示p53在AGPG转录中的重要调节作用，TP53的丢失或突变导致AGPG的显著上调。包括缺氧、DNA损伤和癌基因表达等多个微环境因素下，我们研究了其参与的AGPG调控网络（图5i）。在293 T细胞中，癌基因KRasG12V的表达导致AGPG上调和TP53下调（图5j），表明癌基因应激通过影响TP53状态参与AGPG调控。我们还将我们的分析扩展到缺氧条件下，通过检测暴露于严重缺氧或正常缺氧48小时的细胞中AGPG和TP53的表达。WT和MT p53均如先前报道的那样上调；缺氧后，TP53细胞（KYSE150）中AGPG的表达降低，TP53细胞（TE-1和KYSE30）中AGPG的表达显著增加（图5k）。这些结果表明，在WT-TP53存在下，缺氧诱导的AGPG上调可以被抑制。
图5 AGPG受p53转录调控。
8 AGPG对ESCC肿瘤生长的影响
然后，我们探讨了AGPG在体内肿瘤发生中的作用。AGPG基因敲除显著抑制了基于细胞的异种移植瘤生长（图6a-c）。如血黄素和曙红（HE）和免疫组化（IHC）结果所示，AGPG基因敲除降低了细胞增殖标记Ki67的水平，降低了PFKFB3和CDK1的水平，但增加了p27的水平（图6d，e）；这些结果与我们的体外实验结果一致，在患者来源的异种移植（PDX）模型（使用来自两个ESCC患者的肿瘤组织生成，SYSUCC）（图6f）中，通过体内优化的AGPG抑制剂消耗AGPG显著降低肿瘤生长（图6g-i），表明AGPG是一个有前途的治疗靶点。PDX模型中使用的体内优化AGPG抑制剂的主要成分是反义寡核苷酸，它对核定位RNAs28具有较强的敲除作用。因此，如HE和IHC分析所示，AGPG基因敲除显著影响细胞增殖（Ki67所示），这可能归因于前面提到的PFKFB3和下游CDK1和p27表达的调节（图6j-n）。
图 6 AGPG对体内肿瘤生长的影响
9 p53-AGPG-PFKFB3轴参与ESCC的形成
为了确定p53-AGPG-PFKFB3是否与ESCC的发生有临床关联和病理关系，我们通过qPCR和Ki67检测了AGPG的表达，通过IHC检测了PFKFB3、CDK1、p27和p53的表达。AGPG高组Ki67、PFKFB3和CDK1表达较高，p27和p53表达较低，而AGPG低组则相反（图7a、b）。总之，我们推测p53-AGPG-PFKFB3的失调促进了ESCC的发展。与之前的报道一致，PFKFB3在恶性组织中高表达（图7c，d），并且PFKFB3高表达与ESCC患者的不良预后相关（图7e）。接下来我们通过RNAScope-ISH检测AGPG在这些组织中的表达。然后，将组织分为AGPG/PFKFB3高组、AGPG/PFKFB3中间组和AGPG/PFKFB3低组，其中AGPG/PFKFB3高组的预后比其他组差得多（图7f）。这些数据进一步表明AGPG/PFKFB3是一个有前途的预后指标和潜在的治疗靶点。
图7 p53-AGPG-PFKFB3轴在食管鳞癌中的临床意义
讨论
我们的研究表明，AGPG作为p53的转录靶点，通过增强PFKFB3的稳定性在促进糖酵解和细胞增殖方面起着关键作用，从而促进肿瘤的发展。我们的发现为基于RNA干扰的靶向LncRNA治疗和肿瘤代谢的癌症治疗策略提供了基础。
评论
肿瘤细胞经常通过重新编程其代谢从而快速增殖，但是长链非编码RNA（LncRNA）在代谢重塑中的作用和潜在的机制仍然难以捉摸。我们通过筛选发现LncRNA肌动蛋白γ1假基因（AGPG）可以有效增加食管鳞状细胞癌（ESCC）的糖酵解活性和细胞增殖。从机制上讲，AGPG结合6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3），通过防止APC / C介导的泛素化保护PFKFB3免受蛋白酶体降解，从而导致PFKFB3在癌细胞中积累，随后激活糖酵解途径并促进细胞周期进程。值得注意的是，在患者的异种移植（PDX）模型中，抑制AGPG会极大地损害降低肿瘤的生长速率，在临床上，AGPG在许多癌症中高表达，并且高AGPG表达水平与不良预后相关，这表明AGPG是潜在的生物标志物和癌症治疗靶标。
原文网址：https://www.nature.com/articles/s41467-020-15112-3