科研 | 西北农林科技大学：代谢组+转录组探索调亏灌溉对赤霞珠葡萄花青素合成的影响机制（国人佳作）
编译：一个矫情的农民，编辑：Tracy、江舜尧。
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花色苷是葡萄中重要的水溶性色素，影响葡萄果实颜色、葡萄的品质，最终也会影响葡萄酒的风味，同时，花青素也是重要的营养成分，对人体健康起到和好的作用。植物最佳灌溉量不仅促进植物对养分的吸收，而且还可以提高果实品质。调节亏缺灌溉（RDI）是近年来开发的一种新型节水灌溉技术，在减水的条件下，RDI的应用可以在一定程度上提高园艺作物的经济系数。前期研究表明，RDI可能导致藤蔓脱落，新芽停止生长。适度的水分亏缺可以使葡萄中的总花色苷含量增加30％至50％，并改善花色苷的甲基化程度以及甲基化花色苷在总花色苷中的比例；然而，赤霞珠葡萄中RDI对花色苷生物合成和代谢的作用机理研究仍缺乏系统的研究。因此，本研究的目的是利用赤霞珠浆果中的生化和转录组学与代谢组学相结合，阐明RDI对花色苷生物合成和代谢的作用机理，也阐明了RDI处理后的花色苷代谢途径，并为酿酒葡萄的生长提供理论基础和指导。
论文ID
实验设计
实验结果
1. RDI对葡萄果实理化指标的影响
不同RDI处理的葡萄百粒重如图1A所示。从图1A中可以看出，添加30% ETc的RDI1组能够较CK延缓果实重量的增长，且较CK组提早停止生长，且开花后14周组间差异显著。由于葡萄成熟时严重缺水，RDI1组(105.19 g)和RDI2组(113.73 g)果实重显著低于CK组(127.49 g)，分别下降17.49%和10.79%。
图1B为2018年RDI对葡萄还原糖含量的影响。RDI处理葡萄果实中还原糖含量从开花后10周开始高于CK组；同时，RDI1组还原糖含量比CK组高42.4%，RDI2组比CK组高30.6%。葡萄果实成熟后，差异逐渐减小，但成熟期RDI组的还原糖含量仍高于CK组。RDI1处理组还原糖含量比CK组高17.1%，达到215.85 g/L；RDI2组还原糖含量比CK组高16.3%，达到214.34 g/ L，但2个处理组之间无显著差异。
图1C显示了葡萄从返青到成熟过程中总酸含量的变化。返青期间(特别是开花后10~12周)，RDI组葡萄总酸含量显著低于CK组。在开花后12周时差异最大，RDI1组比CK组降低34.4%，RDI2组比CK组降低33.3%。RDI1组总酸含量略低于CK组，RDI2组略高于CK组，但在成熟过程中无显著差异。葡萄总酸主要由酒石酸、苹果酸和柠檬酸组成，在葡萄浆果开始着色成熟期间，RDI组总酸含量的下降是由于这3种有机酸含量的下降。
可溶性化合物含量与葡萄果实中各种物质的含量有关。可以看出，在成熟过程中白利糖度继续增加(图1D)，RDI组的白利糖度增加较快。在开花后10周时，RDI组可溶性化合物含量显著高于CK组；成熟期RDI1组比CK组高26.6%，RDI2组比CK组高18.2%。可溶性化合物含量主要取决于果实成熟时葡萄的还原糖含量，与图1B基本相同。
随着果实成熟，果汁的pH值逐渐升高(图1E)，pH值很大程度上取决于葡萄的酸含量。综上所述，RDI处理降低了有机酸含量，提高了pH值。在开花后10周和12周时，各组pH值不同，其中RDI1组pH最高，CK组最低。
总花青素含量(TAC)是本试验的关键指标之一。从图1F中可以看出，在开花后8周处，RDI组与CK组的TAC基本相同。在开花后10-16周时，RDI组的TAC显著高于CK组，且每组先升高后略有升高。RDI组的TAC在开花后8周后迅速增加，在开花后12周时达到最大值；CK组的TAC在转色期间逐渐升高，在开花后14周时达到最大值。成熟时，RDI1组的TAC比CK组高28.6%，RDI2组的含量比CK组高2.87%，因此，RDI处理不仅提高了果实的TAC，而且使转色期提前结束。RDI处理上调花青素生物合成相关的一些结构基因的表达导致TAC含量增加。造成这一现象的原因可能是营养生长和生殖生长受到灌水量的影响，水分亏缺会限制营养生长和加速繁殖过程，导致葡萄早熟。
RDI处理降低了浆果重量、产量和可滴定酸度，提高了可溶性化合物和总花青素含量。作者的数据可以看出，适当的RDI处理在轻微缩小果田的情况下，可以提高赤霞珠葡萄的品质。这种果实品质的提高对于酿酒葡萄来说尤为重要，这在一定程度上直接关系到果实的经济价值和最终葡萄酒的品质。RDI处理有效地减少了灌溉水量，很好地适应了中国西北干旱半干旱地区。
图1 葡萄果实的理化指标
(A)葡萄浆果的百粒重。(B)还原糖含量。(C)总酸含量。(D)可溶性化合物含量。(E)果汁pH值。(F)总花青素含量。
2. 葡萄的差异表达基因（DEGs）和转录组分析
从图1F分析可知，开花后8-12周为花青素快速积累的转色期，因此，从每个处理组在开花后10周随机选取葡萄果实进行转录组分析。图2A显示了处理组与生物重复之间的相关性，当值接近1.00时相关性较好，因此，这个数字可以直接反映出不同处理组之间的显著差异，分组比较清楚。图2B显示了不同组合RDI和CK组之间的DEGs重叠，RDI1组与CK组之间存在3991个DEGs，RDI2组与CK组之间存在1198个DEGs，包含551个相同基因。
火山图直观地反映了各RDI处理组与CK处理组基因分布的差异。如图2C和图2D所示，绿点表示表达下调基因，红点表示表达上调基因，黑点表示无差异表达基因。横坐标表示差异表达倍数，纵坐标表示基因显著性差异程度。转录组分析结果显示，RDI1与CK之间存在3991个DEGs，其中1687个上调，2304个下调。RDI2与CK之间存在1198个差异基因，其中403个表达上调，795个表达下调。转录组分析结果表明，RDI影响赤霞珠在转色期的大量基因表达，且DEGs数目随水资源短缺的加剧而增加。
实验筛选了位于类黄酮合成途径下游的大部分花青素合成基因，CK和RDI1、CK和RDI2产生了两个差异基因的热图(图2E和F)。在这两个图中，RDI1和CK组之间的差异更显著，在开花后10周时，Vv4CL和VvFAOMT基因显著下调，其中VvUFGT、VvGDH、VvF3'H、VvF3'5'H、VvC4H、VvLDOX和VvF3H在RDI1中表达显著上调。在图2F中，RDI2组与CK组的每个重复之间的差异不能直接确定，这还需要进一步分析。
图2 转录组学数据的初步分析
(A)不同处理组的相关热图。(B) DEGs的维恩图。(C) CK与RDI1之间的DEGs火山图。(D) CK与RDI2之间的DEGs火山图。(E) CK与RDI1之间DEGs的聚类热图。(F) CK与RDI2间DEGs的聚类热图。
差异表达基因通过GO注释，分为三组：分子功能、细胞成分和生物过程（图3A和B）。在生物过程中，与RDI1和CK代谢过程相关的DEGs共1391个(34.85%)，与RDI2和CK代谢过程相关的DEGs共415个(34.64%)。可以看出，不同程度的RDI会极大地影响葡萄细胞中参与代谢过程的DEGs数量，但参与代谢的DEGs比例与总DEGs的比例相近。
图3 DEGs的GO分类
(A)CK和RDI1之间DEGs的GO功能分类。(B)CK和RDI2之间DEGs的GO功能分类。红色箭头表示与代谢过程相关的DEGs。
3. 花青素合成基因的表达
为了确认RDI对赤霞珠转色期中花色苷生物合成的影响，我们需要对转录组分析结果进行进一步的检验。RT-PCR验证了花青素合成途径中8种关键基因：VvPAL、VvC4H、VvCHS、VvF3’5’H、VvF3H、VvDFR、VvLDOX和VvUFGT的表达(图4)。从开花后8周到14周两组RDI的VvPAL明显高于CK组，并在开花后14周达到最大的差异。CK vs RDI1和CK vs RDI2的相对转录水平差异分别为6.43和3.29，而在成熟期(开花后16周)，两个RDI组中该基因的表达量均显著低于CK。VvC4H的表达量在转色期开始时达到最大值(开花后8周)，CK与RDI1的差异倍数为3.59，CK与RDI2的差异倍数为4.71；随着果实成熟，VvC4H的表达量逐渐降低；在成熟期(开花后16周)，RDI组的VvC4H蛋白表达量低于CK组。重度RDI处理(RDI1)在开花后8周时，VvF3’5’H表达量明显上调，CK与RDI1的差异倍数为23.14倍；另一个基因VvUFGT在重度RDI处理下也表现出较大的上调，CK与RDI1的差异倍数达17.04倍。在开花后8周时，两个RDI组的VvLDOX表达均显著低于CK组；然后，在开花后10周时，该基因在RDI1组中显著上调，这是RDI在遗传水平上的反馈，其机制还需要进一步分析。
图4 与葡萄果皮花青素合成相关基因VvPAL、VvC4H、VvCHS、VvF3’5’H、VvF3H、VvDFR、VvLDOX和VvUFGT的表达
每时期设CK为参照组，记录基因表达量为1。纵坐标值为各处理组基因表达量相对CK组基因表达量的倍数。
当葡萄遭受水分亏缺时，花青素合成途径的8个关键基因在不同时期表现出不同程度的表达变化。VvPAL、VvC4H、VvCHS和VvDFR在转色期上调，而在成熟期下调，VvLDOX的表达在转色期开始时下调，然后逐渐升高，直到果实成熟。不同的基因对水分亏缺的反应不同，葡萄的表型周期也不同；随着亏缺程度的不同，同一基因在同一时期也会有不同的表达。
4. 在转色期，葡萄的不同代谢产物富集在花青素的生物合成途径中
已有研究表明，RDI可导致成熟葡萄酒葡萄中各种花青素含量升高，但其上调的机制和具体细节尚不清楚。因此，我们在中期(开花后10周)检测了赤霞珠浆果中各种单体花青素、类黄酮和黄酮醇，并在这部分实验中进行了代谢组学分析。
由图5A所示的主成分分析可知，对不同样本组进行差异代谢物分组证明了代谢组学分析的下一步工作。在各组比较中，65个代谢物的含量出现差异，各组合共18个代谢物有显著差异(图5B)。进一步分析(图5C和D)，我们可以确定RDI1和RDI2组与CK组的差异代谢物数量(点数)、显著性(纵坐标)和差异倍数(横坐标)。RDI1组有37个上调，1个下调，104个变化不清楚的代谢产物；RDI2有30个上调，2个下调，100个变化不清楚的代谢物。综上所述，灌水量与花青素相关代谢物含量密切相关，随着水分亏缺的增加，上调代谢物的数量也增加。
34种单体花青素和黄酮类化合物的两种聚类热图如图5E和F所示。与CK组相比，RDI1处理显著上调了大部分花青素含量，而对香豆酸、二氢槲皮素、二氢杨梅素等花青素前体的含量均显著下调。RDI2组与CK组相比，上述三种前体的含量仍呈显著下调，芦丁等类黄酮的含量也呈类似的下调。这说明在RDI处理过程中，花青素生物合成途径中大量花青素和类黄酮含量发生了显著变化，尤其是在水分亏缺最严重的RDI1组。
图5 代谢组学数据的初步分析
(A)不同处理组的PCA评分图。(B)SCMs的维恩图。(C)CK与RDI1之间的SCMs火山图。(D)CK与RDI2之间SCMs火山图。(E)CK与RDI1间SCMs的聚类热图。(F)CK与RDI2间SCMs的聚类热图。
5. RDI处理对葡萄果皮花青素单体的影响
为了更准确地验证代谢组学的结果，我们测定了转色期到成熟期葡萄果皮中5种主要单体花青素的含量。这5种单体花青素分别是cyanidin-3-O-glucoside(Cy)、delphinin-3-O-glucoside(Dp)、peonidin-3-O-glucoside(Pn)、petunidin-3-O-glucoside(Pt)和malvidin-3-O-glucoside。
随着葡萄的成熟，各处理组Cy含量逐渐升高，在开花后8周水平较低。随后，两个RDI组的Cy含量迅速上升，在开花后10周时，RDI1组为1.32 mg/L，RDI2组为1.14 mg/L，CK组为0.43 mg/L。开花后14周Cy含量差异最小，成熟时RDI1组、RDI2组和CK组Cy含量分别为2.81 mg/g、2.62 mg/g和2.34 mg/g。
Dp含量与Cy含量差异显著，8 WAF时各组含量相似。在开花后10周时，RDI1和RDI2组Dp含量迅速增加，CK组略有增加，3组Dp含量分别为3.05 mg/g、2.91 mg/g和1.51 mg/g。果实成熟期间，RDI2组Dp含量最高，CK组最低。
Pn含量呈现先升高后略有下降的趋势，各组间差异不显著。果实成熟时，RDI1组、RDI2组和CK组的Pn含量分别为1.90 mg/g、2.01 mg/g和2.17 mg/g。RDI组与CK组间Pt含量变化趋势差异显著，在RDI组中，Pt含量从开花后8周迅速增加到开花后10周，然后基本保持稳定；CK组Pt含量随时间逐渐增加，开花后14-16周时逐渐降低，3个处理组成熟时Pt含量分别为2.63 mg/g、2.31 mg/g和2.15 mg/g。
Mv是葡萄中花青素占总花青素比例最大的单体花青素，因此，Mv含量的变化很大程度上影响了葡萄中TAC的变化。随着果实发育，3个处理组的My含量均呈上升趋势，在开花后10周代谢组学分析中，CK组Mv含量为3.03 mg/g。RDI1组的Mv含量为6.22 mg/g，为CK组的205.28%；RDI2组的Mv含量为5.70 mg/g，为CK组的188.12%。开花后12-16周，RDI1和RDI2组的My含量略有增加，CK组的My含量基本保持不变；葡萄成熟时，3个处理组Mv含量分别为8.68 mg/g、8.09 mg/g和5.71 mg/g。Mv在RDI1组中所占比例最高。
在花青素的检测分析中可以发现，在果实成熟早期，各种单体花青素含量迅速下降，这种现象可能是由于下游代谢反应的激活引起的，不同类型的单体花青素与水分亏缺条件下不同的积累速率有关。在RDI处理下，花青素的积累速度明显加快，且花青素含量达到最大值的时间有所延长，少量单体花青素(如Pn)对RDI不敏感。因此，总体累积速率和趋势与正常灌溉组相似。
可以发现，单体花青素含量与代谢组学分析结果具有显著相关性，代谢组学检测结果可以通过开花后10周时葡萄花青素含量的变化来具体解释，这种现象可能是由于下游代谢反应的激活引起的。因此，赤霞珠在RDI处理期间不仅花青素含量增加，而且在成熟过程中花青素含量仍显著高于正常处理组。
6. RDI处理对花青素合成途径的影响
结合转录组和代谢组学数据，我们清楚地看到不同程度的RDI处理影响整个花青素的生物合成途径(图6)，与CK组相比，两组RDI上游途径的苯丙氨酸没有明显变化，VvPAL基因产生的肉桂酸表现出显著的上调；随后，其在VvC4H、Vv4CL和VvCHS的作用下产生柚皮素，在此过程中RDI1组中有明显的上调；此外，柚皮素的含量在RDI组和RDI1组中均略有上调，且RDI1组上调幅度更大。
代谢途径分析如图6所示，MV、Pt和Dp的单体花青素含量在两个RDI组中均显著增加，它们是飞燕草素代谢途径下游产物。由于Mv与其他单体花青素相比占花青素总量的比例最大，我们推测TAC的大幅增加是由于水分亏缺条件下Mv含量的急剧增加；然而，随着上游前体的Mv，Pt和Dp，DHM的内容显示两RDI组显著下降的趋势，这看似矛盾的结果，这可能是由于上游代谢物的含量低于下游产物或分解代谢产物，具体原因需要进一步的研究。
图6 RDI对花青素合成途径的影响
结论
基于试验的数据，文章揭示了RDI对赤霞珠葡萄果实中花青素合成的影响。RDI提高了可溶性化合物的含量、果汁的pH、还原糖含量和总花青素含量，但百粒重略有降低，总酸含量在成熟前有所下降，RDI1组与CK组差异最显著。转录组学和代谢组学分析显示，RDI组中有大量的DEGs和SCMs被过滤，且随着水分亏缺程度的增加，数量增加。在30% ETc灌水量的葡萄(RDI1)中，花青素生物合成途径中的关键基因VvPAL、VvC4H、Vv4CL、VvCHS、VvF3'5'H、VvLDOX和VvUFGT相关表达量上调；肉桂酸、柚皮素查尔酮、柚皮素等代谢产物在该途径中的含量显著增加；大多数单体花青素含量增加，比例发生变化；Mv所占比例随灌水量的减少而增加。我们的分析揭示了RDI影响花青素苷生物合成的机制，本研究结果为进一步研究水分对花青素积累的调控作用奠定了基础，这些研究最终将有利于RDI措施的推广，可能有助于提高酿酒葡萄的质量。