逆转录RT-PCR实验操作方法

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。以RNA为模板，首先在依赖于RNA的DNA聚合酶的催化作用下体外合成cDNA的第一条链，以此条cDNA链为模板，又可继续进行PCR。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，要得到理想的结果，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。而确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染，关键是要做好实验前的准备，注意实验操作的一些细节。

1.实验前的准备

1.1实验器具的准备：RT-PCR所用的500μl和200μl薄壁EP管、移液器吸嘴最好用进口的，因为进口EP管、移液器吸嘴已经去除了RNasin，也已经灭菌处理过，可以直接用。实验前用干净的镊子夹取出EP管、移液器吸嘴插好备用，注意镊子不要碰到EP管内壁和吸嘴的尖部。如果用国产500μl和200μlEP管和移液器吸嘴，则要提前配制0.05%——0.1%的DEPC水，将EP管、移液器吸嘴和吸嘴盒都浸泡在DEPC水中过夜后再用蒸馏水反复冲洗掉粘附的DEPC，再高压灭菌后60℃烤干备用。注意DEPC有毒，在配制及使用时应在通风橱进行，应全程带手套、口罩。

1.2试剂的准备：做RT-PCR的试剂应提前确定储备量，如试剂量不能满足一次完整的RT-PCR操作，应马上订购试剂，等试剂到了以后再做。因为RNA易降解，提取之后就应立即反转录，或在-80℃冰箱中保存，但是反复冻溶也容易使RNA降解，所以一旦RNA提取或溶解就应立即进行反转录。RT-PCR的试剂都应在冰上溶解。

1.3仪器：高速冷冻离心机、PCR仪、核酸检测仪、凝胶成相系统都应提前检查是否处于正常状态。特别是PCR仪对环境温度有要求时，应提前保证环境温度。

1.4RNA浓度测定：RNA提取后必须测浓度，记录A260吸光度及A260/A280的值，计算RNA浓度及纯度。

1.5反应体系的计算：做反转录时，根据RNA浓度计算出RNA样品的量和DEPC水的量。做PCR时，反应体系根据cDNA的样品数计算每种试剂的量，可以多计算一个（吸嘴和管壁上会粘），混后均分。反应体系的计算是非常重要的，如果出错，不但浪费试剂和样品，结果有错误，也耽误时间。

2.实验操作细节

2.1实验操作过程中必须带口罩、手套，实验室尽量避免人员干扰。

2.2RT-PCR的试剂都应在冰上融化，等完全融化后再取；用过的试剂应瞬间离心后放回-20℃保存；试剂应按顺序加，加完后再混匀离心。

2.3加入试剂前在管壁上做好标记，避免加错试剂；加过一种试剂后将EP管盖子的方向改变，避免重复和漏加；不同试剂和样品要更换吸嘴，避免污染；吸取试剂和样品前检查移液器的标数是否正确，核对正确后再取，避免浪费试剂。

2.4反应体系放入PCR仪前应检查荧光定量PCR仪的反应程序或设计新的反应程序，做PCR时循环参数应根据反应体系来定。

2.5逆转录完成后，产物要加灭菌去了离子水稀释后再做PCR。这一步容易遗忘，不但导致结果异常，还浪费RT产物及其他试剂。

2.6琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是非常重要的，内参的上样量应减半。制胶时要保证上样孔完整，上样时样品孔中不能有气泡，如果有气泡应用移液器反复吹打将气泡赶走；上样时样品不能漏也不能溢，如果上样时枪头插得太深刺破上样孔底部就会使DNA样漏掉，造成假阴性，使结果不准确。如果上样孔容积太小或上样量太多都会使DNA样溢出，造成条带相融合无法比较。只有电泳条带整齐才能保证结果的准确性。在配制琼脂糖凝胶时要加终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）对DNA片段染色。EB染色效果好，但是Ames实验证明，EB是致突剂和可疑致癌物，在使用过程中要带口罩、手套，不要直接接触EB。RT-PCR技术应用广泛，是分子生物学实验中的常用技术，用此方法可利用从哺乳动物细胞中提取的1——2条mRNA建立大量的cDNA文库。此外临床上可用RT-PCR检出病人标本中的引起疾病的RNA病毒，如HAV、HCR、HOV等。操作上的任意一个小失误都可能导致实验失败，特别是如果浪费了cDNA的话，又要重新提取RNA，甚至重新培养细胞，会使整个实验的周期延长，而且实验试剂和耗材都很昂贵。无论从时间、经济以及精力上都是很大的浪费。熟练掌握此项技术，提高实验的准确率对从事分子生物学研究和临床检验的工作人员是非常重要的。

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