高大上的免疫荧光这样准备！
这周特别的忙，可能因为很长时间没有做实验了，手有些生了。复苏了两次细胞都没有成功，幸好第三次成功了。后来发现是孵箱的问题，我自己生气了很久，生气的原因是居然没在第一次未成功时就发现。所以每一次实验都应该当做第一次来做。看来做什么事情都应该保证一定熟练程度。
很开心，今天终于讲到我最喜欢做的实验了，免疫荧光（Immunofluorescence，IFA）。今天主要给大家介绍一些我用过的有关免疫荧光比较好用的产品。
先给大家上一组我做的免疫荧光的图片，包括life image，激光共聚焦，及一般的免疫荧光图片。
(擦干你的哈喇子，我们正式开始)
免疫荧光的原理也是抗原抗体反应，分为直接免疫荧光和间接免疫荧光
要做IFA的细胞需要注意传代代数较低，细胞活性状态好，无支原体感染，细胞铺板的时候细胞密度不要太高。尽量可以看到单个细胞单个细胞样的。
对于做胞内寄生菌或者不同处理组的，根据实验的要求而定，如果想知道单个细胞的信息，就需要把细胞密度铺的稀一点，如果需要知道群体的信息，可以把细胞密度稍微调密一些，但是最好都是单层细胞的。
免疫荧光的基本步骤（针对于贴壁细胞，固定的）
细胞清洗
细胞固定
细胞通透
封闭
孵育一抗
孵育二抗
我们针对免疫荧光的每一步步骤来介绍我常用的东西。
1.细胞清洗
在清洗细胞时，常规用37℃ 1xPBS清洗，此处的PBS需要PH值在7.4左右，需要先把死细胞拍走。另外还可用Hanks液洗细胞。
2.细胞固定
固定液包含纯的甲醇啊，10%的甲醇，冰的丙酮啊，戊二醛啊，4%多聚甲醛，2%的多聚甲醛。这些液体可以自己配置，也可以买公司的。
下面推荐一款ThermoFisher的产品，包括固定，透膜，封闭，抗体孵育。这个产品主演是做流式的，但是我们常常用它来做免疫荧光。时间一般是室温15-25 min。
这款产品主要用于细胞内染色与流式细胞分析，可以减少非特异性染色。分为4步：1.活细胞经固定缓冲液“固定”可与蛋白交联。2.破膜缓冲液可以破膜。3.随后有清洗。4.加入抗体，并采用破膜缓冲液在破膜后进行孵育。最终清洗步骤以及样品检测前使用 Flow Cytometry Staining Buffer（货号 00-4222）制备细胞悬液。
该试剂盒被广泛用于细胞质蛋白以及分泌蛋白（如：趋化因子和细胞因子）的染色。本品不建议用于细胞核内染色。如进行核内染色，可以使用 Foxp3/Transcription Factor Buffer Set（货号 00-5523）。
在做流式时，进行固定步骤之前，建议使用一种 Fixable Viability Dyes（eFluor™450、506、660、780、520 或 455UV）标记活细胞，然后继续进行固定。
3.细胞通透
细胞通透一般选择0.1%-0.5% Triton X-100，室温通透20-30 min。我觉得sigma的Triton要比ThermoFisher的好用，下面第一张是sigma 通透的，第二张是thermofisher通透的。胞膜上的蛋白不需要通透，如果你想检测胞膜上的蛋白或者修饰后的蛋白（比如EGFR和pEGFR）的免疫荧光，或许你可以搜搜sigma啊，Thermofisher，有可能会有相应的ELISA的盒子哦，那个可比IFA方便哦。
4.细胞封闭
做IFA的细胞封闭我都建议不要用BSA什么的，这些背景都不是很好，建议用Invtrogen 专门的封闭液。推荐下面这一款封闭液，超级好用
5.孵育一抗，二抗
这两步都需要用到一个抗体稀释液，很多人都是用2% BSA去稀释，这样背景其实不是很好。有专门的抗体稀释液。假如你不想回收你的抗体的话，其实可以直接用PBS稀释。也可以选择GeneTex的抗体稀释液。具体情况如下图。
如果大家因为课题组没钱，不想去买。下面给大家介绍一个各种实验常用的抗体稀释液配方：
Antibody Dilution Buffers
Antibody dilution buffer is used for diluting primary and secondary antibodies as well as some detecting reagents.
Primary Antibody Dilution Buffer
1%BSA (blocking & stabilizer)
0.1% cold fish skin gelatin (blocking)
0.5% Triton X-100 (penetration enhancer)
0.05% sodium azide (preservative)
0.01M PBS, pH 7.2-7.4
Mix well and store at 4 ºC.
Note:: Do not use it to dilute HRP conjugated antibody as the sodium azide is inhibitor of HRP. Do not use it to dilute Alkaline Phosphatase (AP) conjugated antibody as the phosphate in PBS is an inhibitor of AP.
HRP-conjugated Primary Antibody Dilution Buffer:
1% BSA (stabilizer)0.1% cold fish skin gelatin (blocking)0.05% Thimerosal (preservative)0.01M PBS, pH 7.2 To make 100 ml of the buffer, add 1 g BSA, 0.1 g fish skin gelatin, 0.05 g thimerosal in 100 ml 0.01M PBS, pH 7.2Note:: Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months without reducing binding activity.
Secondary Antibody Dilution Buffer:
0.01M PBS, pH 7.2
0.05% Tween 20
To make 1000 ml of the buffer, add 0.5 ml of Tween 20 in 1000 ml, 0.01M PBS, pH 7.2
Note:
1) Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months without reducing binding activity;
2) Do not use BSA or other serum containing reagents to dilute secondary antibodies since they may bind to BSA or serum therefore reducing antibody affinity;
3) Using TBS to dilute secondary antibodies often produces weaker staining. So use TBS only for the antibodies with high background staining or for alkaline phosphatase conjugated antibodies since phosphate is a inhibitor of alkaline phosphatase;
4) This buffer can also be used for diluting HRP conjugated antibodies since there is no sodium azide in buffer.
AP-Streptavidin Dilution Buffer:
0.05M TBS, pH 7.60.05% Tween 20To make 1000 ml of the buffer, add 0.5 ml of Tween 20 in 1000 ml, 0.05M TBS, pH 7.6Note:
1) Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months without reducing binding activity;
2) PBS can not be used to dilute Streptavidin-AP since phosphate inhibits alkaline phosphatase activity.
Fluorescent Dye (Avidin-FITC, Avidin-Texas Red, Avidin-AMCA) Dilution Buffer:
0.01M PBS, pH 7.2
0.05% Tween 20
To make 1000 ml of the buffer, add 0.5 ml of Tween 20 in 1000 ml, 0.01M PBS, pH 7.2
Note:
1) Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months without reducing binding activity;
2) Do not use serum containing solution to dilute avidin/streptavidin conjugates since serum may contain biotin therefore reducing reaction activity for avidin/streptavidin conjugates.
6.染核
孵育完一抗二抗后就需要染核了，可以买sigma的DAPI粉末配置好后用，也可以去Invtrogen买，我们常用下面这一款。
7.固定，风干
固定的我也是选用Invitrogen 的抗荧光淬灭剂，具体如下。
固定后可以放在37℃的孵箱中，12小时后就风干了。
如果做life image的免疫荧光，建议用直标的抗体，染核用Hochest。我用的也是Invitrogen的。
在这里可能要注意一个问题就是，Hochest会影响宿主细胞的DNA合成代谢，所以不可长时间的使用，但是现在我还没有找到一个很好的替代品。
今天就讲到这里，下周会细讲IFA的步骤和注意事项。