scRNA-seq原始数据的处理
书籍翻译
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希望大家能有所收获！
正
文
处理原始scRNA-seq数据
3.1
FastQC
获得单细胞RNA-seq数据后，首先要做的就是检查已测序的读数的质量。对于此任务，今天我们将使用名为FastQC的工具。FastQC是一种用于测序数据的质量控制工具，可用于bulk和单细胞RNA-seq数据。FastQC将测序数据作为输入，并返回有关读取质量的报告。将此链接复制并粘贴到您的浏览器中以访问FastQC网站：
https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
该网站包含下载和安装FastQC的链接以及所生成报告的文档。幸运的是，我们今天已经为您安装了FastQC，因此我们将查看文档。将网页向下滚动到“示例报告”，然后单击“良好的Illumina数据”。这给出了一个对于高质量Illumina的reads数据来说，理想的报告应该是什么样的例子。
现在让我们自己制作一份FastQC报告。
今天，我们将使用由（Kolodziejczyk等人，2015）生成的mESC数据集中的单个细胞进行分析。使用SMART-seq2文库制备方案对细胞进行测序，并对reads进行配对。文件位于Share。
注意：本课程的当前文本是为AWS服务器编写的，适用于亲自参加我们课程的人员。您必须自己下载文件（ERR522959_1.fastq和ERR522959_2.fastq）并创建Share目录才能运行命令。你可以在这里找到这些文件：
https：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-2600/samples/
现在让我们来看看文件：
less Share/ERR522959_1.fastq
less Share/ERR522959_2.fastq
任务1：尝试找出用于生成FastQC报告的命令。
提示：尝试执行
fastqc -h
此命令将告诉您可以执行FastQC的参数。如果你遇到困难，请随时寻求帮助！如果成功，则应为生成.zip和.html文件，分别对应于forwards和backwards配对的reads文件。一旦你成功了，可以到下一节。
3.1.1 解决方法并下载报告
如果您还没有这样做，请使用以下命令生成FastQC报告：
mkdir fastqc_results
fastqc -o fastqc_results Share/ERR522959_1.fastq Share/ERR522959_2.fastq
一旦命令执行完毕，您应该总共有四个文件 - 每个配对的reads的一个zip文件，以及每个reads的配对的一个html文件。该报告位于html文件中。如果要查看它，我们需要使用filezilla或scp将它从AWS上移到您的计算机上。
文件在您的计算机上后，点击它就可以打开您的FastQC报告。浏览一下文件。记得forwards和backwards匹配reads报告都要查看！读取的质量如何？有什么我们应该关注的吗？我们如何解决这些问题呢？
3.2
trim reads
幸运的是，有可用于trim reads的软件。今天我们将使用Trim Galore！Trim Galore是一个trim reads的软件包。
read trim软件可用于修整测序adapters 和/或读取末端的低质量reads。鉴于我们注意到FastQC报告中存在一些adapters污染，最好从我们的数据中trim掉adapters。
任务2：我们的数据中使用了哪种类型的adapters？提示：查看FastQC报告“adapters content”图。
现在让我们尝试使用Trim Galore！删除那些有问题的adapters。trim后再次检查读取质量，因此在trim完读数后，应使用FastQC生成另一个报告。
任务3：找出应该用来从我们的数据中trim adapters的命令。提示1：你可以使用
trim_galore -h
要了解哪些参数可以传递给Trim Galore。
提示2：仔细阅读上述命令的输出。本实验中使用的adapters非常常见。您是否需要知道adapters的实际序列才能将其删除？
任务3：为修剪后的reads文件生成FastQC报告。adapters污染消失了吗？
一旦您认为您已成功修改了读数并通过查看FastQC报告确认了这一点，请随时使用下一部分检查您的结果。
3.2.1 解决方案
您可以使用以下命令trim adapters：
mkdir fastqc_trimmed_results
trim_galore --nextera -o fastqc_trimmed_results Share/ERR522959_1.fastq Share/ERR522959_2.fastq
请记住为trim后的读取文件生成新的FastQC报告！FastQC现在应该显示您的reads通过了“adapters content”图。如果您有任何疑问，请随时向其中一位教师询问。
恭喜！您现在已生成读取质量报告并执行adapters修剪。在下一个实验中，我们将使用STAR和Kallisto将通过rim和质量检查后的reads对其（align）到参考转录组上。