单细胞测序揭示出小鼠后肢发育过程中的细胞异质性和发育轨迹
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摘要
样品
取材 E11.5、E13.5、E15.5、E18.5,后肢发育从起始到大致完成的4个阶段。
按照时间点取材,胶原酶消化成单细胞后,冻存1 x 10^6 cells per 500μl in freeze media (80%FBS, 10% DMEM, 10% DMSO), 做单细胞实验的时候再取出。
测序
使用10X Genomics,将四个时间点的样本分别和培养的人源293T细胞1:1混合, 检测单细胞的捕获率。
测序2500 cells/sample, 200K reads/cell,2700 genes/cell, 总计9466个细胞
数据 & 质控
数据存放在https://github.com/satijalab/seurat
过滤:200< 每个细胞表达的基因< 6000, 表达超过10%线粒体相关UMI的细胞被筛掉。同时也考虑了细胞周期情况。
数据分析
聚类:使用tSNE,分出 7 clusters,比较不同时期的后肢的细胞类型的不同,计算了不同cluster的比例。作者注意到,其中一个与有丝分裂关系较大的细胞群,在E11.5占比49%,到E18.5只占比8%。其中muscle相关细胞,在E11.5只有1%,到E18.5占比64%
细胞轨迹分析
确定发育轨迹,使用p-Creode,https://github.com/KenLauLab/pCreode
实验验证
RNA FISH
染了以下marker,cartilage (Col2a1), skin (Krt14), and muscle (Myog) tendon (Scx) andbone (Runx2) markers.
总结
作者工作量感觉不是很大,有一个单细胞测序和一个简单的RNA FISH。不知道现在只做一个单细胞测序能发到什么水平的文章。拭目以待。