小鼠原肠胚形成和早期器官发生的单细胞分子图谱
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总览
在动物生命体中，原肠胚的形成代表了一个关键的发育事件，在此期间胚胎多能性细胞分化为谱系特异性前体，将产生成体生物。这篇文章里，作者研究了受精后6.5至8.5天的九个连续时间点收集的来自小鼠胚胎的116,312个单细胞的转录谱。构建了从多能性向所有主要胚胎谱系细胞分化的分子图谱，并探索了涉及内脏和原始条纹衍生内胚层收敛的复杂情况。此外，作者使用单细胞数据分析得到Tal1 -/- 嵌合胚胎在早期中胚层多样化中显示缺陷，显示了时间和转录信息的组合如何阐明基因功能。总之，哺乳动物体内细胞分化轨迹的全面描述对理解发育过程中基因突变的影响，以及对再生医学中优化体外分化方案有重要意义。
背景知识
原肠胚(gastrula)是指具双胚层或三胚层的动物胚胎。由囊胚发育而来。囊胚的部分细胞通过种种方式迁移到内部，形成双胚层或三胚层的原肠胚。双胚层较为低等而三胚层较为高等，它由三层细胞层构成：外胚层(ectoderm)、中胚层(mesoderm)、内胚层(endoderm)。
样本处理
按照时间点解剖小鼠取样：E6.5, E6.75, E7.0,E7.25, E7.5, E7.75, E8.0, E8.25, E8.5
样本及数据处理
10x
建库：10x scRNA-seq library preparation (v.2 Chemistry)
测序：Illumina HiSeq 4000
预处理：软件Cell Ranger 2.1.1，比对mm10基因组并用GRCm38.92注释计数，包括用于嵌合体细胞的tdTomato序列
Swapped molecule removal ：DropletUtils function 'swappedDrops’
Cell calling ：emptyDrops 鉴定barcode，UMI阈值设定为5,000，并且设置P <0.01（Benjamini–Hochberg-corrected ）
Quality control ：排除少于1000个基因表达的细胞文库，去除线粒体细胞，用MAD（median absolute deviation）方法确定阈值。
Normalization ：用R包computeSumFactors分别计算每个数据集的转录组大小因子，用quickCluster函数对细胞进行预聚类。
Selection of highly variable genes ：用R包trendVar和decomposeVar计算高度可变基因（HVG）
Batch correction ：使用R包中的fastMNN函数仅从HVG计算的50个主成分上去除批次效应。
Doublet removal：首先用R包doubletCells计算每个细胞的双重分数，接着用R包buildSNNGraph计算所有基因的前50个主成分，构建共享的最近邻图，并应用Louvain聚类算法来确定每个样本中的细胞簇。仅将HVG用于聚类。
Smart-seq
除了10x，作者还从一批E8.25胚胎中剖开了卵黄囊，尿囊和胚胎，通过流动分选FLK1+ 群体来纯化内皮细胞， 使用Smart-seq2方法做了288个细胞的测序。
建库：Illumina Nextera XT DNA preparation kit
测序：Illumina HiSeq 4000
预处理：用GSNAP47比对mm10基因组。随后使用HTCq38.92进行注释，使用HTSeq48计算比对到每个基因的读数数量；使用三个标准来质量控制。，鉴定和丢弃质量差的细胞：（1）核基因的比对数目<50,000; （2）检测到的基因数<4,000; （3）比对到线粒体基因的读数比例> 10％。丢弃满足任何这些标准的细胞文库。在准备的288个细胞库中，250个通过了质量控制；归一化方法同10x。
Visualization ：用Scanpy计算UMAP
Clustering and cell annotation ：使用HVG-子集表达数据和欧几里德距离（R包的buildSNNGraph）的50个批次校正的主成分构建共享的最近邻图。用Louvain算法从该图调用细胞群。
结果
小鼠原肠胚形成和早期器官发生的单细胞分辨率图谱
作者用均匀流形近似和投影（UMAP：Uniform manifold approximation and projection）图显示了37个主要细胞群。可以看出每个时间点的细胞类型的占比，在整个采样过程中细胞类型复杂性逐渐增加。多能外胚层细胞随着时间的推移开始下降，并且早在E6.75出现中胚层和确定的内胚层谱系。从E7.5开始，外胚层谱系随着器官发生开始时每个胚层的细胞类型的多样化而出现。
早期内胚层发育过程中的分子转化和随后的多样化
前面三张图显示内胚层细胞亚群的力导向图布局（5,015个细胞），分别显示了全局细胞类型注释（cell-type annotation），胚胎收集时间点（embryo collection time point）以及成熟肠细胞类型（Maturing gut cell type ）。
这些细胞涵盖了咽内胚层（表达Nkx2-5），前肠（表达Pyy），中肠（表达Nepn）和后肠（表达Cdx2）。显然，前肠被分成两个簇， 前肠1和前肠2分别可能对应于肝脏和肺前体（参见图热图中的肝相关基因Hhex，Sfrp5和Ttr10-12以及肺相关基因Ripply3和Irx113,14）。后肠细胞也被分为两个不同的簇，即后肠1和后肠2，后肠1中X染色体基因Trap1a和Rhox5的表达显着更高。火山图显示后肠1（n = 53细胞）和后肠2（n = 148细胞）之间的差异表达基因。
血液出现的时间分析揭示早期骨髓细胞
左图是与血液谱系相关的细胞的力导向图布局，15,875个细胞。插图框放大的部分侧重于骨髓，巨核细胞和血液内皮细胞。BP，血液祖细胞; EC，内皮细胞; Ery，红细胞; 血红素，血液内皮祖细胞;MES，中胚层细胞; Mk，巨核细胞; My，骨髓细胞。右图是抽象模拟图，分别显示不同亚群和不同时间点。
将Tal1-/-嵌合体定位到图谱可识别与血液-内皮发育缺陷相关的分子状态
嵌合小鼠胚胎，将Tal1-/- tdTomato+ 小鼠胚胎干细胞注入野生型囊胚，来自嵌合胚胎的tdTomato-（野生型）和tdTomato+（Tal1-/-）细胞在E8.5被取样，然后进行scRNA-seq即分析。
嵌合体细胞的UMAP图（野生型细胞数25,078; Tal1 -/-嵌合型细胞数26,326 ）。数字和图例仅针对在图中清晰可见的细胞类型指定。白色箭头表示血细胞（突变型中细胞耗尽）。
总结
文章显示内脏内胚层细胞的转分化过程有助于胚胎肠道的组成，并且在早期胚胎中出现稀有血细胞。此外，作者用图谱作为分析Tal1-/- 突变体嵌合胚胎的参考，并突出显示TAL1在进入血液谱系中的关键。全面的小鼠原肠胚形成和早期器官形成图谱为研究哺乳动物发育关键时期细胞命运决定的分子基础提供了强大的支持。