综述 | Sci. Total Environ.：地表淡水环境中抗生素的污染：现状和影响
编译：你知道，编辑：小菌菌、江舜尧。
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世界范围内每年抗生素的使用量已经超过了10万吨，目前科研人员对其的关注已经不仅仅是抗生素本身的归趋。抗生素在环境中普遍存在，并且在淡水环境中检出的抗生素浓度非常高。在本文中，作者探讨了淡水环境中抗生素污染的一些重要问题：抗生素在淡水环境中的浓度，微生物对抗生素的敏感性，细菌能够进化出抗生素抗性，以及抗生素污染与其它压力相互作用对食物链的影响。作者通过文献检索，发现了在淡水环境中存在很严重的抗生素污染，在美国，淡水环境中抗生素的浓度能达到15μg/L，这一数值在欧洲和非洲分别能够达到10 μg/L和50 μg/L，在亚太地区的国家甚至能够达到450 μg/L。
虽然这种水平的抗生素污染可能不会对人类造成实际的损害，但是一些非抗生素靶标的淡水生物会被其影响，实验表明，某些抗生素在低于10 μg/L的浓度下就会影响地表水中的微生物，其中包括在河流中普遍存在的抗生素，例如环丙沙星等。半致死浓度下的抗生素并不会杀死原核生物但是会促进其产生抗性并且改变单细胞生物群落的组成，这对微生物的食物链至关重要，最终会影响到更高级的生物甚至整个生态系统的健康。
论文ID
原名：Antibiotic pollution in surface freshwaters: Occurrence and effects
译名：地表淡水环境中抗生素的污染：现状和影响
期刊：Science of the Total Environment
IF：5.589
发表时间：2019
通信作者：Marie-Claire Danner
通信作者单位：Departmentof Life Sciences, Whitelands College, Roehampton University
引言
抗生素是抑制细菌生长或杀死细菌的一类抗微生物类药物，目前存在许多中不同的抗生素，其可以根据作用机制或者化学结构被分为不同的类型，抗生素已经被广泛使用了数十年，致病菌对抗生素的抗性长期都是临床研究中的一个重要课题，并且在近些年，环境中致病菌的抗生素抗性问题也受到了越来越高的关注。抗生素类物质及其代谢物非常的稳定，其并不会被污水处理过程去除，因而能够释放到自然环境中，抗生素在环境中的扩散对于人类健康和生态系统都会产生严重的影响。
抗生素的主要用途是用于治疗致病菌的感染或者在畜牧业中提高牲畜的产量，但是环境中抗生素达到一定浓度之后，其不可避免的就会影响那些原本不是抗生素目标的生物。进入水环境的抗生素可以与自然生物相互作用，其能够改变微生物群落结构及其遗传特性，例如使抗生素抗性基因得以流行。原核微藻特别容易受到抗生素的影响，长期暴露于环境中的抗生素，会增强对于抗性细菌的选择性，其中可能包括潜在的致病菌。另一个研究较少的假说是，抗生素还可能对那些不受抗生素直接影响但以原核生物为食的物种具有间接连锁效应。
主要内容
1 淡水环境中抗生素污染的来源和归趋
1.1 构建人类、鸡和猪肠道微生物组非冗余基因集
本研究使用高通量测序技术分析人类、鸡和猪肠道微生物组中的ARGs及其转录本信息，本研究共获得了大约160Gb的宏基因组数据和大约360Gb的宏转录组数据，经过对宏基因组和宏转录组数据的拼接和开放阅读框识别，最后分别建立了人类、鸡和猪样本的非冗余基因集，结果表明猪的肠道菌群中基因的数目要高于人类和鸡，分别为1,248,314、809,635和312,579个基因。
1.2 宏基因组中ARGs的检出、丰度和多样性
抗生素进入淡水环境有三种主要的途径：污水处理厂、化工厂和畜牧及水产养殖业。据估计，全世界每年的抗生素消耗量在100,000到200,000吨之间，其中约50％用于兽药和作为生长促进剂。在2000年至2010年期间，仅人类一项的全球抗生素消费量就增加了36％，这表明抗生素污染是一个日益严重的问题。
一般来说，50-80%的抗生素会通过尿液和粪便排出体外，其中环丙沙星（50至80％）和四环素（80至90％）的排泄率较高，而红霉素（5至10％）、磺胺甲恶唑（15至30％）或克拉霉素（25％）的排泄率较低。在污水处理系统中，抗生素可以通过在污泥中的生物和非生物降解进行去除，但是这种方式并不能完全去除抗生素，抗生素及其代谢产物最终进入环境（主要是淡水，例如溪流和河流）。在德国，大约70%的抗生素是从医院和住宅中排出，并且其基本上没有被降解。在污水中检测到浓度很高的微污染物。例如，在西班牙Ter河附近的医院污水中，发现奥弗沙星和环丙沙星的浓度超过13μg/L；在瑞典污水处理厂的进水中环丙沙星和红霉素的浓度为分别为1.41μg/L和0.47μg/L，而在处理后的水分别为0.06μg/L和0.35μg/L；从污水处理厂出水到科罗拉多州北部的Cache la Poudre河，氨苄青霉素和奥沙西林的浓度分别为86μg/L和95μg/L；从污水处理厂出水到南非的姆松杜兹河，发现氨苄西林和环丙沙星的浓度分别为9μg/L和27μg/L。在印度海得拉巴附近Patancheru的污水处理厂中，该污水处理厂服务于约90家药品制造商，发现奥沙星和环丙沙星的浓度分别高达160μg/L和31,000μg/L，该区域可以视为一个例外，因为在有限的区域内聚集了众多的制药企业，但尽管如此，抗生素的浓度仍高得惊人。
2 溪流和河流等开放水体中抗生素的浓度
本综述特别关注那些在远离污水处理厂排污口的地区溪流和河流地表水中抗生素浓度的研究。在这些研究中，大多数抗生素浓度通过靶向液相色谱-质谱法（LC-MS）进行测定。共收集了28个国家的54项研究结果，对于抗生素检出报道最多的国家是西班牙和中国。在西班牙的研究中，某些抗生素的检出浓度高于10μg/L，如磺胺吡啶和磺胺甲恶唑，西班牙是关于此项研究数量最多的欧洲国家（15），并且抗生素的浓度最高（地表水中的抗生素平均浓度为1.3μg/L）。在美国，淡水中发现的抗生素浓度约为2μg/L或更低，但磺胺二甲嘧啶除外，其在美国堪萨斯州检出的浓度为15μg/L。在亚洲的河流地表水中抗生素的浓度最高，在Xiao河一个污水处理厂下游20公里的地方，土霉素的浓度依然达到了484μg/L。越南的磺胺二甲嘧啶浓度为19μg/L，奥弗沙星和磺胺甲恶唑分别为17.7μg/L和14.3μg/L。在非洲，莫桑比克的河流中磺胺甲恶唑的含量为53.8μg/L，肯尼亚的河流中为38.9μg/L，在南非的河流中，萘啶酸和环丙沙星的浓度分别为23μg/L和14μg/L。由于缺乏卫生设施和废水处理，低收入国家受污染淡水中抗生素的平均浓度显著较高，亚太地区和非洲的抗生素平均浓度分别为17.7μg/L和11.3μg/L，美洲和欧洲分别为0.9μg/L和0.4μg/L。
3 抗生素的潜在毒性
尽管了解淡水中存在的抗生素及其浓度很重要，但确定这些化合物是否对环境中的不同生物群体产生影响可能更为重要。在实验室中复制复杂的自然环境是十分困难的，目前，对于细菌抗生素敏感性的分析结果大多来自于富集培养体系，而这些结果是否能够应用在天然淡水环境中还有待商榷。为了评估抗生素对非目标生物的毒性作用，通常使用一些专门的生物测定方法，例如EC50（浓度为最大反应浓度的一半）、LC50（浓度为半数致死浓度）、IC50（浓度为半数抑制作用），NOEC（浓度未见效果）和LOEC（浓度为最低观察值）影响）。这些测试通常被认为是个别化学品潜在风险的良好指标，但是没有模型系统，而且设计上也没有考虑到化学-化学或化学-有机相互作用。
Wikipharma数据库整合了包括抗生素在内的活性药物成分的公开可用生态毒性数据（www.wikipharma.org），它是一个免费的，交互式的，全面的，最新的数据库，用于说明药物对非目标动物的影响。作者在该数据库中搜索了使用抗生素和淡水生物进行毒性实验的研究，共得到了49个研究成果，共分析了513种不同实验实验中47种抗生素的作用，其中研究最多的抗生素是甲氧苄啶（57个实验– 11％），磺胺甲恶唑和土霉素（48–9％），氯霉素（35–7％），红霉素（31–6％），奥弗沙星（27–5％），环丙沙星和氨苄青霉素（25–5％），其余的抗生素在不到20个实验中进行了研究。
大部分用于生态毒性研究的抗生素均在淡水环境中有检出，同时大部分生态毒性研究给出了抗生素的EC50指标。欧洲共同体委员规定的有害化学品对水生生物的毒性EC50指标的标准为：10-100mg/L为有害、1-10mg/L为有毒，1mg/L为强毒性。有趣的事，大部分淡水环境抗生素的研究中，抗生素的浓度要低于1mg/L，很多研究表明，10μg/L的抗生素就会对单细胞原核生物和真核生物造成损害。根据Wikipharma的数据，在所有评估抗生素对真核单细胞藻类的影响的研究中，有25％的研究发现EC50值低于1mg/L，还有12个研究甚至报告EC50低于100μg/L。而在Wikipharma数据库中，多细胞菌种的EC50值通常高于1mg/L，平均值均在10-1000mg/L范围内。因此，多细胞菌种似乎对抗生素较不敏感，可能不受溪流和河流中残留抗生素的影响。Wikipharma中还包含许多关于抗生素对后生动物毒性的研究，包括以下物种：鱼类（40个研究），软体动物（16个），甲壳类（117个），轮虫（19个）和刺胞动物（4个），根据结果显示，水环境中的抗生素浓度并不会影响这些动物的存活率、繁殖能力或性别比例。因此，对Wikipharma数据库搜索表明，单细胞生物（原核生物和真核生物）最容易受到低抗生素浓度的影响。
图1 Mikipharma数据库中不同抗生素对应的EC50指标数据，(a)单细胞生物，（b）多细胞生物。
根据对文献数据的检索，本综述的做和根据淡水中抗生素及其毒性确定了一些需要重点关注的抗生素。研究发现，环丙沙星在5μg/L和17μg/L时就会抑制蓝藻铜绿细菌的生长，这一浓度与淡水环境中检出的环丙沙星浓度十分接近，类似的现象也在奥弗沙星、氯霉素、红霉素、诺氟沙星、土霉素、链霉素和泰乐菌素等抗生素中被发现。
生物毒性测定可用于研究新药物的毒性，EC50指标也为我们提供了在环境背景下抗生素毒性的一些迹象，但是，它们并未提供有关抗生素在复杂自然系统中可能具有的真实作用。同样，也没有证明原核生物具有代谢抗生素并响应抗生素污染而进化的能力。
4 天然细菌群落中的抗生素抗性
许多研究将废水中的抗生素存在与污水处理厂影响的河流中的抗生素抗性联系起来，发现抗生素及其相应的抗生素抗性基因（ARGs）之间存在显着相关性，且ARGs的选择性压力随抗生素浓度的增加而增加。众所周知，非常低的抗生素浓度（比临床确定的最低抑菌浓度低10-100倍）可以增加耐药菌的相对丰度，并通过提高适应性进化的速率来选择耐药性。对诸如抗生素之类的抗菌化合物产生抗药性是一个自然过程，其起源与自然环境中的物种间竞争一样，源于许多抗生素本身。因此，在相对原始的水和土壤环境中发现了对抗生素具有抗性的细菌也就不足为奇了。
在临床背景下，人们已经达成共识，即过度使用现有抗生素以及未能发现新抗生素可能是21世纪医疗保健行业的主要挑战之一。可以理解的是，大多数研究都集中在这个问题上，阐明了继发性耐药的遗传决定因素，即突变导致在暴露于抗生素后对抗生素的耐受性增强。因此，虽然广泛的抗药性潜力几乎可以普遍存在，但对于在物种内部和物种之间自然环境中细菌种群之间促进和限制抗药性传播的动力学还知之甚少。重要的是，亚致死水平的抗生素的影响以及由此引起的生理和表型适应受到了环境因素的影响，并且还极大地影响了（未来）耐药潜力。
更重要的是要确定在自然环境中促进和限制耐药性在细菌种群中传播的因素，并确定ARG可能增加的环境，除了抗生素本身外，杀虫剂、消毒剂、金属和植物化学物质同样能够增加细菌对抗生素的抗药性，此外，新的研究表明，微塑料可能是水生生态系统中抗生素和抗性基因的媒介。与其他化学污染物相比，细菌污染物及其携带的ARGs能够在环境中持久存在并扩散，最终可以将转移到人类病原体中，将ARGs从污染源转移到致病菌的能力整合到风险评估中是一项巨大的挑战。
5 在更复杂和真实的环境中评估抗生素
尽管淡水中的抗生素浓度远低于临床相关水平，但它们至少对淡水群落的微生物成分具有直接或间接的影响。现在，环境科学家面临挑战，以证明多种抗生素联合使用以及在全球变化的情况下，抗生素的添加量是否会对淡水生物群落有害。为了分析抗生素对整个生物群落及其驱动的生态系统的真正影响，作者提出了三种主要的未来研究途径：i）食物网，ii）多种抗生素的复合作用以及iii）与其他压力源（例如温度）的相互作用。
抗生素污染对细菌和水生食物网的影响可能很大，但具体的影响很难确定。尽管生物毒性测定法是阐明一种污染物对一个单一物种的影响的有效工具，但它们通常无法提供有关抗生素暴露如何影响物种集合并因此影响生态系统功能的信息。亚抑制浓度的抗生素可能会对物种相互作用产生潜在影响，例如种群动态和细菌群落组成的变化，这可能导致营养相互作用的变化。最近的一项研究还发现，依靠共生或协同作用聚集的群落，更容易受到抗生素的影响，并且由于交叉饲喂在微生物群落中几乎无处不在，因此低抗生素浓度可能会造成非常显著的影响。
除了细菌与细菌的相互作用外，天然微生物群落中的重要相互作用是细菌与原生动物的相互作用。原生动物是以细菌为食的的捕食者，可对细菌的丰度产生深远的影响。一项研究表明，抗生素可以导致其它营养级别的物种连锁反应，细菌通过食物网的适应性级联反应导致捕食者-猎物的丰度比降低，这增加了种群的不稳定性并降低了捕食者的群落。在包括后生动物在内的其他食物网络研究中，Quinlan等人研究了四环素在河流生物膜中的作用，观察到细菌丰度降低，同时藻类生物量和线虫的丰度也出现下降。此外，他们的研究还表明，在四环素停止使用28天后，细菌的生产力得以恢复，但细菌、藻类和线虫的数量却没有恢复。简单的实验室研究可以探讨抗生素是否会改变由细菌、病毒和原生生物组成的微小水生群落的组成，实验室培养体系甚至可以包括较大的无脊椎动物，以探索微生物食物网的变化如何影响较大的无脊椎动物的繁殖。当然，将这些实验扩展到“现实世界”非常重要，自然生物膜是测试抗生素效果的理想系统。
图2 现实环境中抗生素通过级联效应影响整个生态系统的可能性。
环境中抗生素污染的另一个复杂角度是，有机物和食物网都面临着“抗生素鸡尾酒”。在淡水环境中同时检测到不同类别的抗生素是十分常见的现象，因此，水生生物会暴露于多种抗生素的混合物中。在环境中测得的单个抗生素浓度可能较低，但是合计浓度可能导致对水生生物的重大毒性。例如，在西班牙的Llobregat河流域，分析了四种抗生素（红霉素、磺胺甲恶唑、甲氧苄氨嘧啶和奥弗沙星），其单独浓度均很低，但总浓度为2.4μg/L。化学物质混合物中可能存在协同或拮抗地相互作用。因此，研究环境中抗生素之间的潜在相互作用直观重要，但是只有少数研究做到了这一点。各种抗生素的毒性与其相互作用之间的理论联系可以预测抗生素混合物对水生生物的作用，浓度添加（CA）和独立作用（IA）这两个基本概念通常用于评估环境中的药物混合物的毒性。有研究人员使用这两个概念评估了十种喹诺酮类抗生素（从14μg/L到1020μg/L）对测试微生物费氏弧菌的混合物毒性，结果表明，通过添加浓度可以最好地预测混合抗生素的毒性。González-Pleiter使用组合指数（CI）分析了抗生素的毒理学相互作用，结果表明，在环境相关浓度下，红霉素和四环素的组合对绿藻假单胞菌具有协同作用，红霉素和四环素加在一起仅在其单独抑制浓度的1/8处抑制藻类的生长。然而，迄今为止，在多组分混合物中很少观察到协同或拮抗作用。研究环境中抗生素之间的潜在相互作用至关重要，可以对抗生素混合物进行实验室实验，并研究它们对单个物种（细菌）或小型食物网的单一和混合物效应。作为一个响应变量，作者认为细菌对抗生素混合物的适应性是研究的重点，因为对抗生素的适应性会引起细菌群落的变化，而细菌也最容易受到细菌感染。
结论
在本文中，作者的分析表明淡水中的抗生素污染无处不在，并且抗生素在淡水环境中浓度很高。从细菌到多细胞生物，许多抗生素对淡水生物具有毒性；并且即使是亚致死浓度的细菌也具有通过细菌抗性诱导淡水群落变化的能力。这对整个淡水群落中的物种相互作用具有连锁效应，并且由于抗生素彼此相互作用以及与其他应激物相互作用而变得复杂。显然，淡水生态学家拥有分析抗生素污染将如何影响自然淡水群落的工具，作者认为，有可能进行基于最新研究的实验（例如放牧适应细菌的原生动物），以发现在哪些情况下抗生素会影响自然群落（例如原核生物和真菌之间的竞争）以及抗生素如何通过联机效应通过原核生物影响整个生态系统。
显然，多种抗生素的复合污染可会重要的生态系统过程产生影响，例如河流生态系统中有机物的分解，而这些生态系统也承受着压力，例如物种丧失，生境改变和气候变暖。此外，我们还应记住，抗生素不是淡水中唯一的物质，应在与环境关联的情况下、对想换污染物的混合物进行测试和研究。
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