急急急！黄颡鱼“溃疡病”日趋严重，甚至大面积暴毙，氟苯尼考、恩诺沙星...“国标渔药”束手无策...
文/图 华中农业大学 陈昌福、武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军 陆珍珠、浙江省舟山市海洋与渔业局 油九菊 夏枫峰
摘要：本文报告从患“溃疡病”的病黄颡鱼肾脏中分离菌株病进行多种抗生素的抑菌试验结果。从具有典型“溃疡病”症状的黄颡鱼肾脏中分离到4个纯化菌株，采用属于“国标渔药”中的氟苯尼考、恩诺沙星、盐酸多西环素、硫酸新霉素和甲砜霉素，以及尚不属于“国标渔药”的氨苄西林钠和金霉素等几种抗生素类药物，针对4个分离菌株检测了其最小抑菌浓度（MIC）。结果表明，在属于“国标渔药”的几种抗生素中，除盐酸多西环素的MIC为3.13mg/L外，其他几种“国标渔药”的抑菌效果均比较差。而尚不属于“国标渔药”的氨苄西林钠没有显示出抑菌效果，而金霉素则显示出了比较好的抑菌效果，对患病黄颡鱼肾脏中分离菌株的MIC为0.39mg/L。
关键词：金霉素；黄颡鱼；致病菌；最小抑菌浓度
黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）因为其肉味鲜美而深受我国水产品消费者的欢迎。在我国的主要淡水水产养殖区域，黄颡鱼的养殖量呈现出逐步增加的趋势。近年来，也许是由于单位面积内黄颡鱼养殖密度大幅度增加等原因，人工养殖黄颡鱼的“溃疡病”（图1）日趋严重，个别地区人工养殖黄颡鱼还出现了大面积的暴发性死亡（图2），给各地的黄颡鱼养殖业者造成了比较严重的损失。
图1处于不同病理发展时期的黄颡鱼“溃疡病”症状
图2人工养殖黄颡鱼出现暴发性死亡的状况（图片来自网络）
为了阐明引起黄颡鱼“溃疡病”的原因以及追寻致病性病原生物，以期找到有效的防控方法，我们对湖北省武汉市新洲区汪集镇的黄颡鱼养殖业者程浩先生送到实验室的患“溃疡病”的黄颡鱼（图3），进行了病原菌分离，并针对获得的分离菌株完成了多种抗生素类药物敏感性检测，旨在根据药物敏感性检测结果，选择对分离菌株具有良好抑菌效果的抗生素类药物，指导黄颡鱼养殖者对患病黄颡鱼进行了有效防控。
图3从具有“溃疡病”早期症状的黄颡鱼肾脏中分离致病菌
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材料与方法
1.1患“溃疡病”黄颡鱼症状描述
2021年3月2日，新洲区汪集镇黄颡鱼养殖业者程浩先生送来数尾具有典型“溃疡病”症状的黄颡鱼（图1、图3），经过对养殖业者询问，在实验室进行肉眼、显微镜检查患病黄颡鱼体内外症状，得知这些患病黄颡鱼主要呈现有如下典型症状。
在疾病发生初期黄颡鱼的摄食量就出现大幅度下降，病鱼体表出现点状或块状红斑，尤其是头和鳃部的出血症状比较明显（图3）。随后体表开始出现白色斑块，继而出现腐烂，尤其是患病黄颡鱼的躯干部出现溃疡（图1，后期症状）的比例较高，有少数患病黄颡鱼的溃疡是出现在头部（图3）和尾柄部位（图4）。
图4示患“溃疡病”黄颡鱼尾柄出现溃疡的症状
随着病情的发展，体表出现溃疡的症状逐渐明显，腐烂的斑块逐渐扩大，部分饲养池中饲养的黄颡鱼每天的死亡率达到5.0%~6.0%，个别饲养池的死亡率高达10.0%以上。
剖开患病鱼的腹腔，可见大部分病鱼的胃和肠道内尚有少量食物，部分患病鱼的肠道出现所谓“套肠”的症状，患病鱼的肝脏颜色变淡，肾脏有稍微肿胀的现象（图5）。
图5示患“溃疡病”的黄颡鱼呈现“套肠”肝脏颜色变淡和肾脏肿胀的症状
1.2致病菌株的分离
取已经出现典型“溃疡病”症状的患病黄颡鱼，在无菌条件下，从患病黄颡鱼肾脏中采样，在脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）平板上作划线分离，在28℃的恒温培养箱中培养24 h后，从培养皿中挑取单个菌落进行纯培养。用已经纯化培养的4个菌株（菌株编号分别为：HSY01、HSY02、HSY03和HSY04）做分离菌株的药物敏感性检测。同时，分别将不同菌株转接到斜面培养基上，低温保存、备用。
1.3供试药物
选择如下7种抗生素原料药，完成了对从患“溃疡病”黄颡鱼体内分离获得的4个菌株的药物敏感性检测。本次选择的7种抗菌药物原料药分别是氨苄西林钠（Ampicillin Sodium，含量99.8%，批号：20210218）、氟苯尼考（Florfenicol，含量98.2%，批号：20210115）、恩诺沙星（Enrofloxacin，含量：95.8%，批号：20210104），盐酸多西环素（Doxycycline Hydrochloride，含量：95.2%，批号：20201104），硫酸新霉素（Neomycin Sulphate，92.6%，批号：20210204）、甲砜霉素（Thiamphenicol，含量：98.2%，批号：20210108）、金霉素（Chlortetracycline，含量：92.0%，批号：20210202）等7种抗菌素药物用于对分离菌的药物敏感性试验。
1.4最小抑菌浓度（MIC）的测定
依日本化学疗法学会制定的标准法进行[1]。首先将供试药物用适宜的溶媒预溶后，在盛有灭菌脑心浸液（BHI，Difco）培养基试管中，做2倍系列的稀释。制作成药物浓度分别为100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.13mg/L、1.56mg/L、0.78mg/L、0.39mg/L、0.20mg/L、0.10mg/L的药物系列培养基试管。最后，定量吸取0.1mL浓度约为1.2×106cfu/mL活菌液（比浊法测定）加入上述每支试管中，摇匀。置于28℃条件下培养24h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.5对选择治疗用药物及用药方法建议
根据对各种抗生素类药物对分离菌株进行的药物敏感性试验结果，选择对致病菌抑菌效果比较好的药物，并根据药物对不同鱼类的用药系数，换算成每公斤鱼体的用药量后，将用药量和药物使用方法，反馈给水产养殖业者。
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结果
2.1最小抑菌浓度（MIC）
7种抗菌药物在试管内对从患病黄颡鱼肾脏内获得的分离菌株的MIC测定结果如图6所示。由图6所示结果可以看出，氨苄西林钠基本上没有抑菌效果，其他几种水产用抗生素类药物，虽然显示出一定的抑菌效果，但是，均比较弱。在供试7种抗生素药物中，金霉素的抑菌效果比较好。
图6 7种抗生素对患病黄颡鱼肾脏中分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）
7种抗生素对分离菌株的抑菌浓度的详细数据见表1所示。由表1所示结果，可以看出在试验的7种抗生素药物中，氟苯尼考、恩诺沙星、盐酸多西环素和金霉素等几种药物对几个分离菌株的抑菌效果比较好。
表1,各种抗抗菌素类药物对分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）
2.2对选择治疗用药物及使用方法的建议
根据药物敏感性检测结果，建议养殖业者采用盐酸多西环素作为治疗患病黄颡鱼“溃疡病”的药物。参照日本人对日本鳗鲡（Anguilla japonica）的用药系数，可以采用3.13×6.7=20.97mg/kg，即按每公斤鱼体重添加20.97mg盐多西环素药物的剂量，将定量的药物拌和在黄颡鱼的饲料中，连续投喂5天（每天仅投喂1次药物饵料）为1个疗程。
为了保证鱼类能吃到定量的药物，在投喂药物时要注意科学使用粘合剂。具体做法是，将200.0g的小麦面粉制作成稀浆糊后，将药物均匀地拌和在面粉糊中（图7），再将其带有药物的面粉糊，均匀地搅拌在一定量的颗粒饲料中，在避光阴凉处晾干30min后投喂。
图7以面粉糊作为粘合剂拌和药物饲料的情景
为了消灭养殖水体中的病原生物，在投喂药物饵料期间，在试验池塘中泼洒二氧化氯（ClO2）消毒池水。具体做法是临用前剪开ClO2的包装袋，并准确称取所需量，用适量水将ClO2溶解后，在试验池塘内全池泼洒，使饲养池水中的ClO2浓度达到0.30 mg/L，间隔1d后再泼洒1次，连续泼洒2次，即可。
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讨论
在本研究中采用的7种抗生素中，含有属于“国标渔药”的5种抗生素。药物敏感性检测结果证明，从患病黄颡鱼肾脏中分离菌株，对这些抗生素类药物均产生了一定程度的耐药性。而氨苄西林钠虽然不属于“国标渔药”，也没有出现抑菌效果，推测这是由于氨苄西林钠的药理特性决定的，这种药物对革兰氏阳性菌具有比较好的抑菌效果，我们这次从患有“溃疡病”的黄颡鱼肾脏中分离到的菌株，可能是属于革兰氏阴性细菌。而在这次抑菌试验中显示出良好抑菌效果的金霉素，虽然是我国允许使用的兽药，但是，尚不是属于水产用抗生素类药物。
由于这种药物显示出对淡水养殖鱼类致病微生物具有良好的抑菌效果，似乎是在提示我国水产用抗生素类药物的制售企业，值得将完成扩大应用动物对象的相关内容研究后，尽快地将其开发成一种水产用抗生素类兽药。
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