科研 | Plant Molecular Biology：时程转录组分析可更好地理解水稻类根瘤形成过程中的基因调控
编译：秦时明月，编辑：十九、江舜尧。
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植物类根瘤的形成受到多种因素的影响。以往的研究表明，即使在没有细菌存在的情况下，植物激素也可以在植物根部诱导类根瘤的形成，这些结构可以在豆科和非豆科植物的根中被诱导。另外，一些固氮细菌例如茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）以及巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）可以识别并移植到这些根部结构上。因此，解析控制农作物，特别是谷物中类根瘤形成的遗传机制具有重要的农业意义。在前期研究中，研究人员评估了生长素2,4-D处理7天后，类根瘤形成过程中水稻（Oryza sativa）根部发生的转录反应。在本研究中，研究人员调查了在类根瘤形成的不同阶段（早期-1天处理和晚期-14天处理）中水稻根部的基因表达调控情况。在1天和14天处理后，研究人员分别鉴定到了1662和1986个差异表达基因（DEG）。GO富集分析表明，这些DEG集中富含了与生长素应答，信号传导以及与结构发育和形态发生方面有关的基因。在接下来的研究中，研究人员比较了三个时间点（1天，7天和14天处理）的基因表达图谱，并鉴定了在三个时间点唯一或普遍差异表达的基因。另外，为了调查类根瘤形成过程中基因表达的保守性，研究人员将得到的水稻RNA-seq数据与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中的根瘤RNA-seq数据进行了比较。结果表明，控制结瘤和类根瘤形成的分子机制之间存在一定程度的重叠。有趣的是，研究人员发现一些关键的控制根瘤形成的基因在类根瘤形成过程中没有在水稻根部表达。最后，研究人员通过逆转录PCR（RT-PCR）试验验证了几个基因的表达模式。本文为将来研究谷物中类根瘤形成的遗传途径提供了重要的参考意义。
论文ID
原名：Time‑course RNA‑seq analysis provides an improved understanding of gene regulation during the formation of nodule‑like structures in rice
译名：时程转录组分析可更好地理解水稻类根瘤形成过程中的基因调控
期刊：Plant Molecular Biology
IF：3.928
发表时间：2020.2
通讯作者：Arijit Mukherjee
通讯作者单位：阿肯色中央大学
DOI号：doi.org/10.1007/s11103-020-00978-0
实验设计
本研究以生长7天的水稻幼苗作为供试的植物材料，水稻品种为日本晴(Oryza sativa cv. Nipponbare)。取样方式为：1天处理后样品（1-dpt）：野生型水稻根+50μM 2,4-D处理与野生型水稻根+水处理; 14天处理后样本（14-dpt）：野生型水稻根+50μM 2,4-D处理与野生型水稻根+水处理。RNA-seq结果通过逆转录PCR（RT-PCR）进行验证。对RNA-seq结果进行了不同组间的DEG筛选，表达模式分析，以及GO富集分析，包括不同类根瘤形成阶段的水稻根系RNA-seq结果分析，与类根瘤形成不同阶段相关的基因表达的分析，最后比较了蒺藜苜蓿根瘤与水稻类根瘤形成过程中的基因表达模式。
结果
1不同类根瘤形成阶段的水稻根系转录组分析
研究人员分析了两对处理组中野生型水稻（Oryza sativa cv.Nipponbare）根的表达谱：（1）1天处理后样品（1-dpt）：野生型根+50μM 2,4-D处理与野生型根+模拟处理; （2）14天处理后样本（14-dpt）：野生型根+50μM 2,4-D处理与野生型根+模拟处理。主成分分析（PCA）显示，在1和14 dpt的生物学重复之间有高度相似性（图1a）。主成分分析（PCA）显示，在1和14 dpt的生物学重复之间有高度相似性（图1a），并且对照样品比相同阶段的处理样品显示出更高的相似度(图1a)。1-dpt的差异表达分析确定了1662个DEG（图1b）。在这1662个DEG中，有816个基因表达上调，846个基因表达下调。在14-dpt中，研究人员确定了1986个DEG（图1c），在这1986个DEG中，有909个基因表达上调，有1077个基因表达下调。
为了确定这些DEG的功能，本研究进行了GO富集分析（图2）。对于1-dpt处的1662个DEG，研究人员总共确定了27个GO富集分类，其中包括对刺激物的响应，结构大小的调节，生长相关，信号传导等（图2a）。其中在上调的基因中检测到了26个GO富集分类，在下调的基因中检测到了4个GO富集分类（图2a）。而在14-dpt的DEG中，总共确定了七个GO富集分类，包括结构生长和形态发育等（图2b）。其中，在上调的基因中发现了34个富集分类，在下调的基因中发现了15个富集分类（图2b）。
2不同类根瘤形成阶段基因表达谱的比较
该研究比较了在类根瘤形成期间水稻根部基因在三个时间点（1-，7-和14-dpt）下发生的表达变化（图3），其首先确定了至少在一个时间点差异表达的3486个基因，并将它们的表达量绘制为热图，以直观的展示其表达随时间的变化（图3a）。在这三个时间点中，研究人员发现了574个共同的DEG（图3b）。在这些共同差异表达的基因中，鉴定出了七个GO富集分类，包括对刺激物的反应等（图3c）。有趣的是，在仅于1-dpt和14-dpt中表达的88个DEG中没有发现任何明显的GO富集分类（图3c）。另外，1-dpt中的722个DEG，7-dpt中的685个DEG，以及14-dpt中的500个DEG是特异的（图3b）。这些结果表明在不同的时间点，控制类根瘤的水稻根部基因表达活性不同。
另外，本研究调查了在这三个时间点（1-，7-和14-dpt）中上调的DEG（图4）。研究人员首先确定了至少在一个时间点表达上调的1758个基因，并根据其表达随时间的变化将它们绘制为热图（图4a）。共有208个DEG的表达在所有的时间点中上调（图4b）。在这些基因中，共有26个GO富集分类被鉴定出来，包括对刺激物的反应，信号转导，形态发生以及对结构大小的调节（图4c）。另外，在1-和14-dpt的30个共同上调基因中未发现任何明显的GO富集分类。
3 与类根瘤形成不同阶段相关的基因表达
（1） 转录因子
该研究鉴定了至少在一个时间点差异表达的314个转录因子（图5a），并进行了GO富集分析，包括对刺激物的反应，结构形态发生等。在这个数据集中确定的转录因子包括AP2/ERF，ARF，LOB，GRAS转录因子，以及包含NAC结构域的蛋白质，WUSCHEL相关的同源蛋白质等。
该研究鉴定了至少在一个时间点差异表达的348个蛋白激酶（图5b），并进行了GO富集分析，包括信号转导和结构形态发生等。检测出的蛋白激酶主要为富含亮氨酸重复的家族蛋白，富含半胱氨酸的受体激酶，植物磺肽激素受体激酶等。
该研究鉴定了至少在一个时间点差异表达的313个转运蛋白（图5c），并进行了GO富集分析，包括运输和对内源性刺激的响应等。确定的主要转运蛋白包括生长素外排载体，ABC型转运蛋白，MATE外排载体和几种根瘤蛋白（MtN21，MtN3等）。
4 蒺藜苜蓿根瘤与水稻类根瘤形成过程中基因表达的比较分析
为了鉴定类根瘤和根瘤形成过程中基因表达的保守性，研究人员对蒺藜苜蓿根瘤和根中的DEG，与在水稻根部类根瘤形成过程中至少在一个时间点表达的DEG进行了比较，并鉴定出了1202个同源基因（图6）。但是本研究并没有调查它们在蒺藜苜蓿根瘤和水稻根部中的关系。有趣的是，在蒺藜苜蓿根瘤和水稻类根瘤中，许多基因被共同上调或下调，但这并非绝对。例如，有一组基因的表达在所有时间点上的蒺藜苜蓿根瘤或水稻类根瘤中都被上调（图6d）。而另一组基因的表达在所有时间点上的蒺藜苜蓿根瘤中被下调，但在水稻类根瘤中被上调（图7f）。研究人员还确定了在蒺藜苜蓿中结瘤所需的一些关键基因，但其在水稻类根瘤形成过程中并未在水稻根中表达。
结论
本研究利用全面的时程RNA-seq分析了基因在多个时间点的表达模式，为某些基因如何参与水稻类根瘤器官发生提供了重要的参考。在1天处理后和14天处理后，研究人员分别鉴定到了1662和1986个差异表达基因。GO富集分析表明，这些差异表达基因集中富含了与生长素应答，信号传导以及与结构发育和形态发生方面有关的基因。另外，通过鉴定蒺藜苜蓿根瘤和水稻类根瘤中的同源基因及其表达模式也显示了在豆科植物根瘤和谷类作物类根瘤器官发生中可能起关键作用的基因表达模式存在一些重叠。另外，在类根瘤形成过程中，一些关键结瘤基因的直系同源基因未在水稻根中表达。未来的研究可以集中分析仅在类根瘤内部发生的转录组反应，并且比较类根瘤和豆类根瘤内部发生的基因表达变化。
评论
近年来，转录组测序(RNA-seq)已被用于提高我们对关键生物学过程中基因调控和信号网络的理解。总体而言，这种全面的时程RNA-seq分析将为以后的研究提供良好的资源，以表征控制类根瘤形成的遗传途径。值得注意的是，在晚期处理的时间点中（7和14-dpt），本研究只对包含类根瘤的根部进行了RNA-seq，在这些含有类根瘤的根中观察到的基因表达变化也可能受其他生长素反应的影响。尽管如此，本研究中讨论的一些候选基因的功能表征将改善我们对这些根器官发生机制的理解，这对从事豆科植物-根瘤菌共生和改善非豆科植物固氮的科学工作者具有重要的参考价值。
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