编译：Sophie，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
外源细胞分裂素对体外芽再生至关重要。参与细胞分裂素信号转导途径的蛋白质，包括B型拟南芥反应调节因子（ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORs，ARRs），参与拟南芥芽再生。一些B型ARRs（如ARR1和ARR12）通过直接激活WUSCHEL（WUS）表达来促进芽再生；然而，目前还不清楚B型ARRs是如何抑制芽再生的。本文发现ARR12是愈伤组织形成和芽再生的重要促进因子，而ARR1是这一过程的强抑制因子，抵消了ARR12的正调控作用。ARR1通过与ARR12竞争结合CLV3启动子，以ARR12依赖的方式间接抑制CLAVATA3的表达，这有助于ARR12依赖性抑制愈伤组织的形成和芽再生。同时，ARR1通过激活生长素反应抑制基因吲哚-3-乙酸诱导物17（INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE17，IAA17）和间接抑制WUS表达来抑制芽再生。因此，B型ARRs对愈伤组织的形成和芽再生有不同的影响。本研究揭示了连接细胞分裂素信号、CLV3调节因子和生长素信号的新的分子途径，并揭示了细胞分裂素调控芽再生的机制。
原名：The Type-B Cytokinin Response Regulator ARR1 Inhibits Shoot Regeneration in an ARR12-Dependent Manner in Arabidopsis
译 名：B型细胞分裂素应答调节因子ARR1以依赖ARR12的方式抑制拟南芥芽再生
期 刊：The Plant Cell
IF：9.618
发表时间：2020.03
通讯作者：向凤宁
通讯作者单位：山东大学生命科学学院植物发育与环境适应生物学教育部重点实验室
DOI号：10.1105/tpc.19.00022
1 ARR1是芽再生的抑制因子
为了确定ARR1在芽再生中的作用，本研究对根外植体进行再生试验。评估了在CIM中的来自arr1-4突变体，过表达ARR1（AOE）转基因系，以及arr1-4突变体补充ARR1pro:ARR1-GFP（以下简称RS[rescued]系）的根外植体的愈伤组织形成能力。培养21d后，arr1-4突变体形成的愈伤组织比野生型多70%，RS系的愈伤组织数量与野生型相同，AOE系的愈伤组织比野生型稍少（图1A和1B）。培养7d后，arr1-4的愈伤组织形成比野生型更多（图1C和1D），但RS系中的愈伤组织没有如预期的那样（图1C和1D）。这些数据表明ARR1降低了愈伤组织形成的能力。在SIM培养14d后，从arr1-4植株获得的根外植体再生出的新梢多于野生型植株（图1E、1F和1H）。来自AOE系的根外植体产生的芽数少于野生型，而RS系的根外植体的芽数与野生型相同（图1E、1F和1H）。尽管arr1-4外植体已经形成了比野生型或RS外植体更致密的细胞团，但在转移到SIM的7天内，任何根外植体都没有形成芽（图1G和1I），但是从AOE系获得的外植体形成的致密细胞团较少（图1G和1I）。因此，根外植体中ARR1转录物的丰度与再生芽的数量呈负相关（图1E至1I），表明ARR1抑制芽再生。接下来，将CIM诱导的来自arr1-4、AOE和野生型植物的根外植体愈伤组织转移到添加了不同浓度N6-（2-异戊烯基）腺嘌呤（2-ip）和0.15 mg/L吲哚-3-乙酸（IAA）的新鲜SIM上。arr1-4愈伤组织再生芽的数量多于野生型愈伤组织，但0.05 mg/l2-ip的存在阻碍了所有外植体的再生（图1J-1S）。在2-ip浓度分别为1.0和2.0 mg/L时，AOE愈伤组织再生芽的数量少于野生型愈伤组织（图1N-1Q）。arr1-4、AOE和野生型系的下胚轴外植体对不同浓度的2-ip和0.15 mg/L IAA的反应相似。这些结果表明，ARR1对芽再生的抑制作用与局部细胞分裂素浓度无关。
图1 ARR1抑制根外植体的芽再生。
(A, C)野生型(Col-0)、arr1-4、AOE和RS的根外植体在CIM上培养21 d (A)和7 d (C)后形成愈伤组织。
(B, D)培养21 d (B)和7 d (D)后愈伤组织数目。数据代表平均值±标准差(n=24)。
(E-F) Col-0、arr1-4、AOE和RS的根外植体在SIM上培养14 d后芽再生。4个独立的AOE株系和3个RS株系表现出相似的表型。
(G)来自Col-0、arr1-4的根外植体在SIM上培养7 d后形成致密的细胞团。
(H-I)培养14 d后再生芽数(H)和培养7 d后致密细胞团数(I) (n=24)。
(J-S) 在含0.05 mg/L N6-(2-Isopentenyl)腺嘌呤(J、K)、0.5 mg/L N6-(2-Isopentenyl)腺嘌呤(L、M)、1.0 mg/L N6-(2-Isopentenyl)腺嘌呤(N、O)、2.0 mg/L N6-(2-Isopentenyl)腺嘌呤(P、Q)和5.0 mg/L N6-(2-Isopentenyl) 腺嘌呤(R、S)的培养基上培养14 d后，Col-0，arr1-4和AOE根外植体的愈伤组织芽再生和再生芽数。所有培养基均含0.15 mg/L IAA。数值代表平均值±标准差(n=23)。**和***:分别表示差异P ＜ 0.01和0.001 (t检验)。刻度条:在A、E、R中1 cm；C、G中100 μm；2.5 mm (F)。
2 ARR1以依赖ARR12的方式抑制芽再生
为了了解不同B型ARR基因的作用，我们对arr1、arr10、arr11、arr12和arr18外植体及相应的双突变体进行再生分析。在SIM培养14 d后，arr1外植体的芽再生数是野生型的3倍，arr12外植体的芽再生数仅为野生型的四分之一，arr10的再生芽数稍少。含有arr12的双突变体产生的芽再生数均与arr12单突变体相似或更少，无论其他哪个基因发生突变。arr11 arr18双突变体形成的芽数与野生型相同。此外，补充了ARR12pro:ARR12的arr12突变体其芽再生缺陷。这些结果表明，B型ARRs在调控体外芽再生过程中存在功能差异，ARR12是这一过程的重要促进因子，ARR1是这一过程的强抑制因子。为了探讨ARR1和ARR12的关系，本文对野生型和arr1、arr12和arr1 arr12突变体的愈伤组织和芽再生能力进行了研究。arr1单突变体产生的愈伤组织（图2A、2B和2E）和芽（图2F、2G和2J）比野生型多，表明ARR1抑制愈伤组织的形成和芽再生。然而，在没有ARR12的情况下，arr1 arr12双突变体产生的愈伤组织数量与arr12单突变体的相似（图2C-2E）和更少的芽（图2H-2J），表明ARR1在这种情况下促进了芽的再生。因此，ARR1介导的抑制愈伤组织形成和芽再生依赖于ARR12的存在。与arr1和arr1 arr12相比，野生型和arr12之间的差异显著减小（P<0.001，图2A、2C、2F和H），表明ARR1通过抵消ARR12的正调控作用来抑制愈伤组织的形成和再生。
图2 ARR1对芽再生的抑制作用取决于ARR12的存在。
(A-D) Col-0、arr1、arr12、arr1 arr12根外植体在CIM上培养21 d后愈伤组织形成。
(E) CIM培养21 d后愈伤组织数。数据代表平均值±标准差(n=24)。
(F-I) Col-0、arr1、arr12、arr1 arr12的根外植体在SIM上培养14 d后的芽再生。
(J) CIM培养14 d后再生芽数。数据代表平均值±标准差(n=24)。***:表示P < 0.001(t检验)。标尺:1 cm。
在花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，ARR1在野生型外植体中的表达与未转化的野生型外植体相比导致了更少的芽。相比之下，35Spro:ARR1转基因在arr1 arr12双突变体中的表达比arr1 arr12双突变体的外植体导致更多的芽。这些数据表明，当细胞分裂素信号转导被阻断时（如arr1 arr12双突变体），ARR1的过表达略微促进了芽的再生；然而，在野生型外植体中，ARR1的过表达可能通过改变外植体中ARR12的功能来抑制芽再生。arr1外植体中ARR12的转录水平在CIM培养2 d和SIM培养4 d后略低于野生型外植体，而arr1和35Spro:ARR1幼苗的ARR12转录水平略高于野生型。野生型和arr12外植体或幼苗之间的ARR1转录水平没有显著差异，而35Spro:ARR12幼苗的ARR1转录水平与野生型稍高。这些结果表明，ARR1和ARR12在芽再生过程中对其他基因的转录影响较小。
3 ARR1和ARR12对芽再生的影响是由不同的蛋白质功能和表达模式决定的
为了探讨ARR1和ARR12对芽再生的不同影响是否由其编码基因的不同蛋白功能或表达模式决定的，本文对不同ARR1和ARR12水平的外植体的芽再生能力进行了评价。外植体芽再生能力排序为arr1 arr12＜arr12< arr12 + ARR12pro:ARR1 < Col-0 < arr1 < arr1 + ARR1pro:ARR12（图3A-3F和3K）。
图3 ARR1和ARR12对芽再生的差异作用是由其蛋白功能和表达模式决定的。
(A-F)在SIM上培养14 d的根外植体的芽再生，包括arr1 arr12 (A)、arr12 (B)、ARR12pro:ARR1 arr12 (ARR1和ARR12启动子控制ARR1的表达) (C)、Col-0 (D)、arr1 (E)和ARR1pro:ARR12 arr1 (ARR12在ARR1和ARR12启动子的控制下表达) (F)。
(G-J) 在SIM上培养14 d后根外植体的芽再生，包括Col-0 (G)、35Spro:ARR12转基因株系1号和2号(H, I)和35Spro:ARR1转基因株系(J)的根外植体。
(K, L)培养14d后再生芽数。数据代表平均值±标准差(n=24)。***:差异P < 0.001(t检验)。标尺:0.5 cm。在不同的遗传背景下分析了两个独立的转基因株系，表现出相似的表型(C, F, H, I)。
arr1-arr12双突变体外植体（没有ARR1或ARR12表达）在SIM上培养14 d后几乎没有产生芽（图3A-3F和3K）。arr12单突变体（保留内源性ARR1基因）比arr1 arr12双突变体产生更多的芽（图3A、3B和3K）。含有ARR12pro:ARR1转基因的外植体在arr12单突变体中（ARR1在ARR12启动子和内源ARR1启动子控制下表达）比未转化的arr12单突变体产生更多的芽（图3B、3C和3K），但少于Col-0的芽（来自内源基因座的ARR1和ARR12表达水平正常）（图3C、3D和3K）。arr1单突变体（保留内源性ARR12基因）比Col-0产生更多的芽（图3D、3E和3K）。在arr1单突变体中含有ARR1pro:ARR12转基因的外植体（ARR12在ARR1启动子和内源ARR12启动子控制下表达）比未转化的arr1单突变体产生更多的芽（图3E，3F和3K）。因此，在相同启动子（即ARR1和ARR12启动子）控制下表达的ARR1和ARR12对外植体的芽再生能力有不同的影响（图3C和3F）。与这些结果一致的是，35Spro:ARR12转基因的外植体比Col-0产生更多的芽（图3G-3I和3L），而含有35Spro:ARR1转基因的外植体比Col-0生成的芽更少（图3G、3J和3L）。此外，内源性ARR1pro:ARR1不能补充arr12突变体表型，而ARR12pro:ARR1转基因可以部分挽救arr12表型（图3C和3D），表明在不同启动子控制下ARR1的表达对芽再生的影响略有不同。
4 ARR1和ARR12在芽再生过程中的定位和积累模式
在CIM上培养根外植体0和2 d后，在中柱细胞和其他根细胞层中检测到ARR1信号（图4A和4B）。根外植体在CIM上培养5 d后，大部分ARR1信号与中柱细胞和中柱周围的细胞有关（图4C）。根外植体在SIM上培养2、4和7 d后，细胞内层的ARR1信号水平增加（图4D-4F）。在7 d观察到新SAMs形成时没有观察到特定的GFP信号（图4F）。在SIM上培养10 d后，我们在整个外植体中检测到ARR1，包括在成熟的SAMs中（图4G）。
图4根外植体芽再生过程中ARR1的时空表达模式。
(A-G) ARR1pro:ARR1-GFP根(A)的ARR1沉积位置和根外植体在CIM上培养2 d (B)、5 d (C)和SIM上培养2 d (D)、4 d (E)、7 d (F)、10 d (G)。白色虚线(B)显示生成的愈伤组织。(A-C)中的箭头表示ARR1-GFP在根外植体中柱细胞中的定位。(G)中的箭头表示SAM成熟时ARR1在外植体中的分布。标尺:50 μm。对两个独立的转基因株系进行了分析，结果表明它们具有相似的表达模式。
在CIM上培养根外植体0和2 d后，在中柱细胞中检测到ARR12信号。根外植体在CIM上培养5 d后，大多数ARR12-GFP信号与中柱细胞和中柱周围细胞有关，与ARR1-GFP信号一样。根外植体在SIM上培养2、4、7 d后，ARR12信号水平高于移入SIM前，GFP信号位点与新SAMs信号位点一致。
5 ARR1以ARR12依赖的方式通过调节CLV3和WUS的表达来抑制芽再生
本文测量了野生型（Col0）、arr1和AOE外植体中与芽再生相关的各种基因的表达水平。CIM上Col-0和arr1突变体的外植体之间的WOX5表达没有显著差异，而在SIM上培养4、7和10天后，arr1外植体中WOX5的表达水平高于Col-0。在CIM上培养5天，在SIM上培养2天和4天后，arr1外植体中的SCR表达略高于Col-0。在SIM上培养10天后，arr1外植体中IAA3和IAA14的表达高于Col-0外植体。在CIM上培养5天后，arr1外植体中ARR5、ARR7和ARR15的表达低于Col-0。CLV3是SAM中一种成熟的干细胞调节因子。在CIM上培养时，CLV3在Col0外植体中的表达逐渐增加，在SIM上培养4 d后达到高峰，CLV3在外植体中广泛分布（图5A和5D）。在SIM上培养7 d后，CLV3转录本分布减少并集中在某些区域，最后定位在SIM培养10 d后形成的SAMs中（图5A）。在CIM和SIM上，arr1单突变体的根外植体中CLV3转录水平显著高于Col-0的根外植体（图5A、5B和5D）。在arr12和arr1 arr12外植体中，CLV3的转录水平远低于Col-0（图5A、5C和5D）。此外，AOE外植体中ProCLV3:GFP-GUS的GUS信号弱于野生型。这些数据表明ARR12是CLV3表达的关键正调控因子，ARR1负调控CIM和SIM培养期间外植体中CLV3的表达，ARR1对CLV3表达的显著抑制需要ARR12的存在。
图5 ARR1以ARR12依赖性方式显着抑制CLV3的表达。(A-C) 在CIM上培养2 d，3 d，5 d并且在SIM上培养2 d ，4 d，7 d，10 d，CLV-3在Col-0 (A)，arr1 (B)和arr12 (C)根外植体中的时空表达模式，。(D)在CIM上培养0 d，2 d，5 d以及在SIM上培养4 d，7 d，10 d，Col-0、arr1、arr12和arr1 arr12的根外植体中CLV3的转录丰度。相对表达水平用Col-0 CIM 5 d的数据标准化。(E)在ARR1pro:ARR1-GFP和ARR12pro：ARR12-GFP转基因外植体上进行ChIP分析后，CLV3启动子片段的富集。黑框表示核心细胞分裂素应答motif 5'-GAT(T/C)。(F-H)瞬时表达实验显示，ARR1和ARR12通过结合CLV3启动子区域的相似位点(F, G)来激活其表达，而ARR1和ARR12促进CLV3表达而无协同效应(H)。(I, K, M, O) Col-0 (I)、arr1 (K)、arr12 (M)和arr1 arr12 (O)根外植体在SIM上培养4 d后CLV3启动子的时空转录活性。(J, L, N, P) 在SIM上培养4 d，突变CLV3启动子(mCLV3)在Col-0 (J)、arr1 (L)、arr12 (N)和arr1 arr12 (P)根外植体中的转录活性。每个遗传背景分析了两个独立的转基因株系，表达水平相似(I-P)。对CLV3启动子序列的评估显示在起始密码子的2091 bp上游序列中有29个重要细胞分裂素反应motif 5'-GAT（T/C）（图5E）。对转基因ARR1pro:ARR1-GFP和ARR12pro:ARR12-GFP外植体在新生的SAM形成阶段（SIM 7d）进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析发现，ARR1和ARR12与CLV3启动子的重要细胞分裂素反应motif结合（图5E）。在拟南芥原生质体中的瞬时表达分析表明，与CLV3pro:LUC+空载体相比，CLV3proLUC+35Spro:ARR1和ProCLV3:LUC+35Spro:ARR12中的荧光素酶信号更强（图5F和5G）。当18个重要细胞分裂素反应motif（在CLV3起始密码子的1400 bp上游序列内）发生突变（mCLV3），mCLV3pro:LUC被35Spro:ARR1和35Spro:ARR12的激活与野生型CLV3启动子相比减少（图5F和5G）。这些数据表明ARR1和ARR12与CLV3启动子的相同位点结合并调节其表达。然而，与未观察到协同效应的35Spro:ARR1或35Spro:ARR12单独转化相比，当35Spro:ARR1和35Spro:ARR12在瞬时表达系统中共转化观察到等量的荧光素酶信号（图5H）。mCLV3pro: GFP-GUS的信号强度与在Col-0中的CLV3pro:GFP-GUS相比急剧下降（图5I和5J）。与Col-0相比，arr1中mCL3pro:GFP-GUS和mCL3pro:GFP-GUS的GUS信号大大减弱（图5K和5L）。arr12和arr1 arr12外植体中的CL3pro:GFP-GUS和PmCL3pro:GFP-GUS的信号非常弱（图5M和5P）。这些数据支持了ARR1与ARR12竞争CLV3启动子结合区域并间接抑制其表达的假设。观察到ARR1抑制CLV3的表达，说明CLV3在ARR1的下游发挥作用。为了验证这一假设，本文比较了arr1-4、clv3-7、arr1-4 clv3-7和野生型根外植体产生愈伤组织和芽的能力。与其他基因型相比，clv3 -7根外植体产生的愈伤组织和芽数较少(图6A、6B、6E、6F、6G和6J)，证实CLV3促进愈伤组织的形成和枝的再生。与arr1-4相比clv3-7单突变体相比，arr1-4 clv3-7双突变体产生了中等数量的愈伤组织和芽 (图6B- 6E和6G-6J),这表明CLV3的部分功能丧失挽救了arr1-4表型,并且CLV3在ARR1下游起到调节芽再生的作用。
图6 CLV3作为ARR1的下游调控芽再生。
(A-D) Col-0、clv3-7、arr1和arr1 clv3-7的根外植体在CIM上培养21 d后形成愈伤组织。
(E)培养21 d后愈伤组织数。数据代表平均值±标准差(n=28)。
(F-I) Col-0、clv3-7、arr1和arr1 clv3-7的根外植体在SIM上培养14 d后的芽再生。
(J) 14 d后芽再生数。数据为平均值±标准差(n=28)。***:差异P < 0.001(t检验)。标尺:1 cm。
WUS是芽再生的关键调节因子。本文检测了ARR1或ARR12是否调节WUS的表达。通过RNA原位杂交证实了WUS在转基因WUSpro:GFP-GUS根外植体中的表达模式。在CIM上的任何外植体中均未检测到WUS表达。当外植体在SIM上培养时，诱导Col-0外植体的WUS表达，并在SIM上培养7 d后达到峰值。最后，在SIM上培养10 d后，WUS的表达集中分布并位于新形成的SAMs中。arr1外植体中WUS的转录丰度在SIM上培养4 d后达到高峰，在SIM上培养7 d后开始集中，时间早于Col-0，并在SIM上培养10 d后定位于新形成的SAMs。WUS的表达在arr12外植体中低于野生型，在arr1 arr12外植体中更低。因此，ARR12是WUS表达的重要正调控因子，而ARR1是WUS表达的弱正调控因子，并且在ARR12存在的情况下诱导WUS在外植体中广泛分布。也证实了ARR1和ARR12通过竞争性结合到WUS启动子的相同位点来调控WUS表达。
6 ARR1通过转录激活IAA17来抑制芽再生
通过RNASeq对SAM形成初期arr1、AOE和野生型根外植体的转录组进行比较，发现了许多差异转录基因(DTGs)。在arr1 vs野生型外植体的转录组中，分别检测到了177个上调和260个下调的DTGs，而在AOE vs野生型转录组中，分别检测到了129个和6个DTGs(图7A)。arr1 vs野生型中DTGs在参与激素信号转导和吲哚生物碱合成通路中的表达较高(图7B)。这些DTGs还包括参与生长素运输和信号转导有关的基因，以及编码在arr1根外植体中下调Aux/IAA的抑制因子IAA17(图7C)。在CIM上，IAA17在Col-0外植体中表达量略有上调，在SIM上4 d后达到峰值(图7D)。在SIM上培养7和10 d后，IAA17转录水平下降(图7D)。在CIM和SIM培养过程中，arr1中的IAA17转录水平低于Col-0根外植体(图7D)。在含有IAA17pro:GFP的转基因根外植体中，分析芽再生的不同阶段发现，arr1中的GFP信号都弱于野生型(图7E和7F)。这些结果表明，ARR1促进IAA17的表达。
图7 ARR1通过与IAA17启动子结合来促进其表达。
(A)arr1 vs. Col-0和AOE vs. Col-0的差异转录基因(DTGs)。
(B)arr1 vs. Col-0中DTGs的通路富集。
(C) arr1 vs.Col-0中，与生长素运输和信号转导相关的DTGs转录谱分析。
(D)在CIM或SIM上培养的不同的阶段，Col-0和arr1根外植体中IAA17的转录丰度。相对表达水平用Col-0 CIM 5 d的数据标准化。
(E-F)在CIM上培养5 d并在SIM上培养2 d，4 d，7 d和10 d后，IAA17在野生型（E）和arr1（F）根外植体中的时空表达模式。arr1 IAA17pro:GFP系是通过arr1和IAA17pro:GFP的植物杂交获得的。
(G)ChIP后IAA17启动子片段的富集。
(H)瞬时表达分析表明ARR1促进IAA17表达。
(I)ARR1与EMSA中IAA17的启动子区域（箭头所示）结合。
(J-K)IAA17pro:GFP和mIAA17pro：GFP在新生SAM形成阶段的根外植体中的时空表达模式。黑框是指细胞分裂素应答motif 5'-(A/G)GAT(T/C)，黑框标有“×”表示A-to-C和G-to-C点突变。**：P <0.01（t检验）。比例尺：50 μm。针对每种遗传背景分析了两个独立的转基因系，具有相似的表达模式(C，F，J，K)。
对IAA17启动子序列的扫描显示，存在6个拷贝的细胞分裂素响应motif [CRM, 5'-(A/G)GAT(T/C)]和1个扩展的细胞分裂素响应motif [ECRM, 5'-AAGAT(T/C) tt3 '] (图7G)。对SAM形成初期ARR1pro:ARR1-GFP外植体进行ChIP分析，表明ARR1特异性结合到IAA17启动子的含核心细胞分裂素响应motif的特异性结合区域(图7G)。当IAA17pro:LUC或mIAA17pro:LUC在含有35Spro:ARR1的拟南芥原生质体中瞬时表达时，突变的启动子信号水平较低(图7H)。电泳迁移率转移分析(EMSA)证实ARR1在体外与IAA17启动子结合(图7I)。此外，含有mIAA17pro:GFP转基因植物的GFP表达效率低于含有IAA17pro:GFP的转基因植物(图7J和7K)。这些结果表明，ARR1通过直接结合IAA17启动子区域来促进其表达。在CIM培养过程中，IAA17在arr12和野生型根外植体中的转录丰度相似，而在SIM上培养7、10和14 d后，IAA17的转录丰度在arr12中比野生型根外植体更丰富。但是，35Spro:ARR12在拟南芥原生质体中激活了IAA17pro:LUC报告基因，而mIAA17pro:LUC没有，并且共转化35Spro:ARR1和35Spro:ARR12对IAA17pro:LUC表达无协同作用，说明ARR1和ARR12通过竞争性结合IAA17的启动子来调控其表达。
研究了35Spro:VP16- IAA17mImII(VP16-IAA17激活因子，以一种不依赖生长素的方式激活生长素应答基因)和显性突变体axr3-3(携带一个的功能等位基因IAA17抑制因子)的愈伤组织形成能力和芽再生能力。与Col-0相比，axr3-3的根外植体在CIM上培养7 d后形成了分离的圆顶状的愈伤组织(图8A)。35Spro:VP16-IAA17mImII的根外植体沿整个维管柱生成连接的愈伤组织(图8A)，在CIM上培养21 d后最终形成连接的愈伤组织柱，与arr1的表型相似(图1A)。在SIM培养基上培养7d后，圆顶型的axr3-3愈伤组织形成根原基样结构(图8B)，最终形成根(图8C)，未形成致密的细胞团或芽再生 (图8D和8E)。但是，与Col-0相比，连着的35Spro:VP16-IAA17mImII愈伤组织增殖迅速，形成大量致密的细胞团(图8B和8D)和芽(图8C和8E)。来自两个独立的T-DNA插入缺失功能的IAA17突变体的根外植体，iaa17 -lof-1 (iaa17 -loss of functional -1，SALK_011820)和iaa17 -lof-2 (SALK_065697)，与野生型相比，产生了更多的芽，表明IAA17抑制了芽再生。
图8 IAA17在离体芽再生过程中起着ARR1下游的作用。
(A) CIM培养7 d后根外植体形成愈伤组织，包括Col-0、axr3-3、和35Spro:VP16-IAA17 mImII的根外植体。标尺:0.5 cm。
(B)Col-0、axr3-3和35Spro:VP16-IAA17 mImII的根外植体在SIM上培养7 d后形成密集的细胞团(箭头表示)。标尺:50 μm。
(C)在SIM上培养14 d后，Col-0、axr3-3和35Spro:VP16-IAA17 mImII的根外植体中芽再生。标尺:1 cm。
(D, E) 新生分生组织阶段的密集细胞团数(D)和芽再生阶段的再生芽数(E) (n = 24)。
(F) Col-0、AOE、35Spro:VP16-IAA17mImII和AOE 35Spro:VP16-IAA17mImII在芽再生阶段的再生能力。标尺:1 cm。
(G)再生芽数。数据代表平均值±标准差(n=24)。
(H) Col-0、arr1、axr3-3、arr1 axr3-3在芽再生阶段的再生能力。标尺:1 cm。
(I)再生芽数。数据代表平均值±标准差(n=24)。***:平均值差异P < 0.001(t检验)。
比较了AOE，35Spro:VP16-IAA17mImII，双过表达，野生型四种基因型的根外植体芽再生的能力。AOE外植体比野生型产生的芽数少，而35Spro:VP16-IAA17外植体产生的芽数多(图8F和8G)。AOE 35Spro:VP16-IAA17mImII双过表达系产生的芽与35Spro:VP16-IAA17系一样多 (图8F和8G)，表明35Spro:VP16-IAA17mImII转基因完全挽救了AOE表型。接下来比较了axr3-3、arr1、axr3-3 arr1双突变体和野生型根外植体的芽再生能力。axr3-3 arr1外植体没有产生芽，与axr3-3外植体相似(图8H和8I)。这些结果表明，在离体芽再生过程中，axr3-3挽救了arr1的表型，IAA17作用于ARR1的下游。在SIM上培养后，35Spro:VP16-IAA17mImII根外植体的WUS表达强度和表达范围大于野生型外植体，而axr3-3外植体WUS表达强度和表达范围较低(图9A-9C)。比较了arr1、iaa17-lof-2、wus-101及双突变体(arr1 iaa17-lof-2、arr1 wus-101、iaa17-lof-2 wus-101、和arr1 iaa17-lof-2 wus-101)和Col-0 8种基因型对根外植体的芽再生能力。arr1-和iaa17-lof-2外植体比野生型产生了更多的芽，而wus-101没有产生芽(图9D-9G)。arr1 iaa17-lof-2双突变体产生的芽数与arr1相似（图9E、9G和9H），这与IAA17作用于ARR1下游的观察结果一致。arr1 wus-101、iaa17-lof-2 wus-101和arr1 iaa17-lof-2 wus-101的外植体均未能产生芽（图9I-9L）。这些结果表明，在体外芽再生过程中，ARR1和IAA17在WUS上游起作用。
图9在离体芽再生过程中，ARR1和IAA17在WUS上游起作用。
(A-C) SIM培养2、4、7、10天后Col-0 (A)、axr3-3 (B)和35Spro:VP16-IAA17 mImII (C)根外植体的WUS时空表达模式。在SIM上培养7 d和10 d后，新形成的SAMs中出现了WUS信号。
(D-K) Col-0、arr1、iaa17-lof-2、wus-101、arr1 iaa17-lof-2、arr1 wus-101、iaa17-lof-2 wus-101的芽再生能力。标尺:1 cm。
(L)再生芽数。数据代表平均值±标准差(n=28)。***表示差异P < 0.001(t检验)。
最终作者提出了一个B型ARRs对愈伤组织形成和芽再生的作用模型(图10)。ARR1和ARR12在芽再生过程中对CLV3和WUS的调控作用很复杂。在CIM和SIM上培养的外植体中，ARR12强烈激活CLV3的转录，增强了愈伤组织的形成和芽的再生。B型ARRs对愈伤组织的形成和再生有不同的影响。
图10 ARR1通过间接抑制CLV3和直接激活IAA17来抑制芽再生。
(A) ARR1和ARR12竞争性结合到CLV3的启动子区域。ARR12对CLV3转录的强激活被ARR1显著抑制，可能是通过它们与CLV3启动子的竞争性结合。因此，ARR1以ARR12依赖的方式间接抑制CLV3表达，从而抑制愈伤组织的形成和芽再生。
(B) ARR1通过直接转录激活IAA17来抑制芽再生。另外，B型ARRs通过直接激活WUS表达来促进芽再生。
