科研 | Theranostics：M2巨噬细胞源性外泌体促进血管内支架植入后血管组织修复过程中血管平滑肌细胞的c-KIT表型
编译：怀瑾，编辑：景行、江舜尧。
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论文ID
原名：M2 macrophage-derived exosomes promote the c-KIT phenotype of vascular smooth muscle cells during vascular tissue repair after intravascular stent implantation
译名：M2巨噬细胞源性外泌体促进血管内支架植入后血管组织修复过程中血管平滑肌细胞的c-KIT表型
结果
1 血管内支架植入后，M2巨噬细胞与c-KIT + VSMCs相邻
通过将316L裸金属支架（BMS）从左动脉植入SD大鼠的腹主动脉，鉴定c-KIT + VSMCs在支架植入部位的存在和位置。免疫荧光图像显示支架植入后第7天，新内膜中有大量SM22α+细胞表达c-KIT。支架置入后第28天，在支架支杆周围发现很少的c-KIT- +SM22α+细胞，而在新内膜的支架丝周围发现了大量的c-KIT和SM22α双阳性细胞，且内膜SM22α+细胞中的c-KIT和SM22α双阳性细胞在支架置入后7天和28天分别从13.64％显着增加至63.78％。为分析修复区域与c-KIT +细胞之间的关系，研究者沿着支架血管的近端直至远端检测c-KIT +细胞的分布（图1A）。通过表面染色，发现位于支架血管远端的支架支柱周围有6.14％的c-KIT +细胞（图1B和1D），而在支架血管的近端和中间部位，c-KIT +细胞占比分别为不到1％和1.79％。接下来，研究者对腹主动脉支架内的CD68进行表面染色，以进一步研究巨噬细胞的出现和定位是否与c-KIT + VSMCs同步。支架植入后第7天，在支架植入节段的远端发现了CD68 +细胞，而正常腹主动脉中CD68阳性细胞较少（图1C）。在支架植入血管的远端发现每平方毫米有近60个CD68阳性细胞（图1E）。通过免疫组织化学的方法在植入支架的血管远端检测到MAC-2（总巨噬细胞的标记）和YM-1（M2巨噬细胞的标记）。在新内膜支架周围发现了MAC-2 +细胞和YM-1 +细胞。且在支架置入后7天和28天，YM-1 +细胞可进一步深入到正在发育的新内膜并与VSMCs相邻。支架植入后7天和28天，正在发育的新内膜中MAC-2 +细胞分别为8.77±0.64％和2.23±0.20％；YM-1 +细胞分别为7.32±0.45％和1.43±0.14％。这些发现表明，M2巨噬细胞可能是c-KIT +细胞参与支架植入后损伤应答的关键调节剂。
研究者下一步建立了Transwell共培养系统，以探索巨噬细胞是否可以增强VSMCs的祖细胞形成。将带有荧光染料的初始巨噬细胞（M0）、LPS +IFN-γ刺激的巨噬细胞（M1）和IL-4 + IL-13刺激的巨噬细胞（M2）与经DIO染色的A7R5共培养 24小时。与各种巨噬细胞共培养后，A7R5细胞的形态从长纺锤形转变为多边形。A7R5 VSMCs中红色荧光DII染料的出现表明经DII着色的细胞膜从Transwell上部的巨噬细胞传递到接种在下部孔的受体VSMCs中。与M0和M1巨噬细胞胞外囊泡（EVs）相比，VSMCs倾向于从M2巨噬细胞吸收更多的EVs。但只有与M2巨噬细胞共培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMCs）才表现出DII染色的细胞膜明显聚集。A7R5的立体坐标视图确认了来自M2巨噬细胞的EVs已被整合到细胞中。
通过免疫染色检测干细胞标志物c-KIT之后，在共培养模型中发现下室VSMCs的c-KIT上调（图3A）。同时利用蛋白质印迹分析VSMCs与巨噬细胞共培养后其c-KIT，α-SMA和SM-22α蛋白水平，结果显示与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中c-KIT表达上调，但α-SMA和SM-22α表达水平下调。此外，与M0和M1巨噬细胞EVs处理组相比，吸收M2巨噬细胞EVs的VSMCs具有F-肌动蛋白骨架解聚作用（图2C）。硬度变化可以间接反映VSMCs的去分化。研究者利用胶体探针原子力显微镜（AFM）来验证巨噬细胞是否可以调节VSMCs的硬度。首先利用巨噬细胞条件培养基（M2巨噬细胞上清液：DMEM = 1：9）或通过Transwell共培养刺激RASMCs，当球形和RASMC接近时的力曲线表明，在M2巨噬细胞刺激下，RASMCs力曲线的斜率较小（图2D）。JPK软件分析显示，在条件培养基刺激或与M2巨噬细胞共培养后，RASMCs的硬度显著降低（图2E）。用10 µM GW4869（一种外泌体生物发生/释放抑制剂）预处理THP-1巨噬细胞，而后进行了IL-4 + IL-13刺激。发现当GW4869抑制巨噬细胞分泌外泌体后，与M2巨噬细胞共培养的VSMCs的c-KIT表达并没有上调。在mRNA水平上，外泌体抑制后，c-Kit、SM22α和α-SMA的表达恢复到对照组水平。这些实验表明，M2巨噬细胞源性外泌体可上调经刺激M2巨噬细胞后VSMCs中c-KIT的表达。
透射电子显微镜（TEM）（图3A）和纳米粒子跟踪分析（NTA）（图3C）显示，M2巨噬细胞上清液中提取的外泌体直径约为100 nm。为证实VSMCs可直接吞噬外泌体，将标记有17nm 金纳米颗粒的外泌体与RASMCs孵育12小时。17nm 金纳米颗粒标记的囊泡被VSMCs吞没，并可以通过TEM检测到（图3B）。在体外，随时间进行 VSMCs吸收更多经DID染色的M2Es。同时，VSMCs的F-肌动蛋白丝被解聚并重新排列（图3D）。处理24小时后，M2Es内化的VSMCs的3D图像显示F-肌动蛋白的解聚发生在DID染色的M2Es周围（图3E）。时间动态检测显示，在24小时后DID染色的M2Es吸收达到最大值（图3F）。VSMCs与纯化的M2Es共培养，以阐明M2Es是否在VSMCs中诱导祖细胞的增强和硬度变化。与对照组相比，与M2Es共培养的RASMCs明显比正常RASMCs更软。
未经处理和经M2Es处理的RASMCs杨氏模量分别为1308±49.94 Pa和232.3±14.76 Pa（图4A和4B）。暴露于M2Es之后，VSMCs也会逐渐变为球形。长轴与短轴的比率从5.620±0.3676降低到2.161±0.1652。P3-RASMCs的F-肌动蛋白骨架经M2Es处理后被破坏（图4C）。接下来，研究者假设M2Es可能在蛋白质水平上引起VSMCs去分化。用M2Es处理24小时后，VSMCs具有高水平的c-KIT表达，且VSMCs中SM22α的丝状结构不再存在（图4D）。通过蛋白质印迹法检查了未处理和M2E刺激的RASMCs中c-KIT，SM22α和α-SMA的蛋白水平。结果表明，M2Es刺激组c-KIT表达高度上调，SM22α和α-SMA被下调（图4E和4F）。M2Es刺激或与M2巨噬细胞共培养后，RASMCs中SM22α和α-SMA的表达显著降低，而干细胞标志物c-Kit显着增加。未检测到其他两个标记Sca-1和Oct-4（图4G）。这些数据强烈表明M2Es对RASMCs去分化至关重要。
研究者假设在大鼠模型中腹主动脉支架植入后，M2Es可以增强VSMCs的血管修复能力。形态计量分析发现与对照组相比，在7天和28天时用M2Es处理的支架血管的新内膜面积有所增加，但在7天和28天时，新内膜厚度和新内膜与内膜的比率无明显差异。在第7天，与对照组相比，M2Es处理的支架血管狭窄百分比显著增加。此外，在7天和28天时总血管面积和内侧面积无显著差异。与PBS处理相比，M2Es处理的大鼠在28天时在新内膜中包含更多的MAC-2巨噬细胞，并在7天和28天时具有更高的YM-1 +巨噬细胞。这些数据表明M2Es导致支架血管内的炎症细胞表型改变。经M2Es处理大鼠的新内膜病变在7天和28天时含有更多的c-KIT和SM22α双阳性细胞（图5A-C）。与PBS处理相比，M2Es处理的大鼠在第7天和28天时新内膜中含有更多的c-KIT +和SM22α，从而降低了内膜中的SMCs（图5D）。但对培养基中的细胞进行定量，未观察到细胞去分化的差异。免疫组织化学显示，与PBS处理组相比，M2Es处理组新内膜中发现的PCNA +细胞更多。
研究者通过RNA-seq比较RASMCs和与M2巨噬细胞共培养的RASMCs基因表达谱，以进一步表征与M2巨噬细胞共培养的RASMCs。KEGG富集分析显示与此相关的途径是MAPK信号传导、内吞作用、粘着斑、细胞衰老、流体切应力、动脉粥样硬化和自噬。基于这些发现，推测MAPK途径在VSMCs去分化过程中起重要作用。与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中上调的基因与已知的干细胞特征相关（Kitlg，Cd44，Sox17，Klf4，Nkx-5，Flt1和Rexo1）（图6A）。此外，SMC特征性基因在与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中被下调（图6A）。尽管RNA-seq并未检测到与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中c-Kit的水平变化，但qRT-PCR确实发现经M2Es处理的RASMCs中c-Kit有所增加（图9B）。生物信息学分析显示，在与M2巨噬细胞共培养的RASMCs中，MAPK / AP-1途径基因（Sos1，Sos2，Rras2，Kras，Nras，Rras，Braf，Map2k1，Rps6ka1，Rps6ka2，Fos和Fosl1）的表达显著增加，表明AP-1活性增加。且AP-1活性增加可能是M2Es诱导的RASMCs去分化的原因。qRT-PCR证实Fosl1和其他AP-1依赖性基因在吸收M2Es的RASMCs中高表达（图6B）。M2Es处理的大鼠在7天和28天与PBS处理组相比，新内膜中高表达AP-1（图6C）。研究者进一步使用T-5224 (AP-1的特异性抑制剂)探究AP-1是否在VSMCs去分化过程中发挥功能性作用。qRT-PCR证实T-5224在M2Es处理的RASMCs中有效抑制AP-1活性（图6D）。在存在M2Es和T-5224（10μM）的条件下培养24小时后，RASMCs中的MAPK / AP-1通路基因和干细胞相关特征性基因被下调，而SMC相关特征性基因被上调（图6D）。免疫荧光检测显示，AP-1抑制后，M2Es刺激的RASMCs中c-KIT的表达显著下调（图6E）。同时抑制AP-1后，由M2Es引起的F-肌动蛋白变化也逐渐恢复（图6F）。此外，T-5224还显著抑制M2Es诱导的RASMCs增殖（图6G和6H）。
讨论
本研究揭示了M2巨噬细胞与VSMCs之间的细胞通讯，可促进支架植入后的再内皮化，发现其潜在的作用机制即M2Es通过M2巨噬细胞→外泌体→MAPK（AP-1）途径增加VSMCs去分化。VSMCs与M2Es共培养导致VSMCs的去分化是本研究的亮点之一，这表明M2Es可诱导具有c-KIT +干细胞表型的VSMCs增多，从而介导受损血管的修复。外源性M2Es可在短时间内增加血管损伤后血管平滑肌细胞的干性，并增强其血管愈合能力。未来研究的挑战将是确定M2巨噬细胞外泌体（M2Es）中诱导VSMCs表型转变的成分。
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