综述 | Current Opinion in Plant Biology：单细胞测序及其在植物维管束细胞中的应用前景
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Single cell RNA sequencing and its promise in reconstructing plant vascular cell lineages
译名：单细胞RNA测序及其在植物维管细胞重建中的应用前景
期刊：Current Opinion in Plant Biology
IF：7.508
发表时间：2019.5
通讯作者：Siobhan M Brady
通讯作者单位：加利福尼亚大学
DOI号：10.1016/j.pbi.2019.04.002
主要内容
1单细胞RNA测序技术现状
单细胞RNA测序可以识别处于中间分化状态以及定义之前未定义的细胞类型。而目前只有少数几项研究在植物中使用了单细胞测序。分析植物单细胞测序获得的数据的一项重大进展是开发了“细胞身份指数”（ICI）算法，该算法利用了拟南芥研究提供的大量数据用于“诊断”细胞类型。本研究将说明这种方法以及一般的单细胞测序方法如何能够深入了解植物关键维管组织发育的生物学机制。
2单细胞RNA测序平台
单细胞RNA测序平台可以分为两类，基于微孔或者液滴的方法（图1a）。基于微孔方法包括SMART seq2，SCRB（图1b）和CEL-Seq。这些方法要求将细胞直接分选到孔中，因此需要使用先前确定的细胞类型标记用于荧光激活细胞分选（FACS）。这些方法的不同取决于它们的cDNA合成方法，随后将用于制备文库的转录本进行扩增，以及是否使用唯一的分子标识符(UMIS)来鉴定PCR产生的重复（图1a-b）。基于液滴的方法包括inDrop，DropSeq和10XGenomics平台。这些方法将单个细胞和barcode与寡oligo(T)引物相结合。与微孔法相比，液滴法可以捕获更多的细胞，但是测序深度较低。在拟南芥中，利用SMART-seq测序构建根干细胞生态位再生细胞的发育轨迹，利用Drop-Seq绘制根尖以及木质部细胞分化的单细胞图谱。10XGenomics已经应用于根细胞的测序，尤其关注根表皮细胞以及整个拟南芥根尖细胞。这些方法目前还没有应用于其他植物中。
3“诊断”细胞类型
确定细胞类型同一性最直接的方法是将已知标记与数据集中的其他基因相关联。该方法已经应用于鉴定rhd6和gl2突变体中毛细胞和非毛细胞比例的变化。Seurat包可以执行这些不同类型之间的关联分析，并且可以识别最有可能的细胞簇的标记。ICI算法是另一种方法，在典型发育时期使用自拟南芥的根细胞类型表达谱图谱的数据，并且响应于环境而开发一组标记，该标记集可以“诊断”细胞类型。计算SPEC值，该值使用基于信息论的方法来表示每个转录本提供的用于确定细胞类型的信息性。识别每种细胞类型的标记基因，这些标记基因在特定细胞类型中高表达，但在大多数其他细胞类型中呈背景水平，以及具有较高的Spec得分，因此具有高度信息性。在每个单独的细胞中，所有基因的平均表达是针对预定义的标记集确定的，并且对于给定的细胞类型，每个基因由其Spec值加权。然后根据所表达的标记基因的比例调整Spec值。确定每种细胞类型的ICI分数，然后将其归一化到0-1的范围。自检，其中在1000个排列中获得与原始大小相等的随机化标记集，用于获得ICI分数的零分布，并且使得能够确定置信度度量。该算法已经用来跟踪根尖细胞在再生一个新的干细胞生态位时的发育状态信息。
拟南芥的根部呈放射状排列，表皮，皮层和内胚层围绕维管束鞘的最外层组织中柱。维管系统由韧皮部和木质部组织以及含有维管干细胞的未分化的原形成层组成（图2a）。与其他植物细胞相反，筛管分子(SE)和管状木质部分子(TE)失去全能性，最终细胞分化。几十年来，维管细胞在根部最内层的位置阻碍了对其发育的研究。单细胞测序和现代活体成像的结合为研究这些组织的发育轨迹开辟了新的途径。本研究重点介绍维管细胞的形成，完善单细胞技术进一步深入目前对维管细胞发育轨迹的理解。
4维管发育：空心化
维管细胞的发育进程受植物内及其附近植物相对细胞位置的影响较大。在拟南芥根的中柱内，TE（初生木质部和次生木质部）将维管束一分为二，两个韧皮部彼此相对并被形成层包围（图2a）。韧皮部组织由光合同化物传导筛管分子（SE）和装载和卸载营养物质的必须的伴胞（CC）组成，CC与SE紧密相连。为了形成传导单元，TE和SE细胞经历了复杂的、不同的形态发育过程。首先，根细胞通过从与静止中心相邻的细胞发出的位置信号获得维管细胞特性，随后是增殖阶段，类似于运输放大的干细胞。通过伸长达到最终大小后开始分化。与分化相关的首要特征就是次生细胞壁（SCW）以环状/螺旋状(初生木质部细胞)或网状凹陷(次生木质部细胞)的形式组装。伴随这一过程，木质部细胞经历程序性细胞死亡(PCD)和自溶。顶端和基部被降解的空心元素彼此毗连形成一个连续的系统，将水分和养分输送到地上器官。与TE相反，初生韧皮部在根分生组织中形成其形态分化特征，然后继续伸长阶段。作为分化的第一步，细胞壁由纤维素沉积增强，随后细胞核收缩。这一过程最终导致细胞质的稀释和细胞器的选择性解体，包括细胞核、液泡、高尔基体和细胞骨架的退化。
5揭示维管细胞未特征化的发育阶段
目前对韧皮部和木质部分化的遗传调控的了解主要来自于整个组织的高分辨率转录图谱。分化细胞的微阵列分析可以识别该过程的几个关键调控因子，包括维管相关NAC结构域6和7（VND6，VND7）。这两种转录因子作为主要控调控因子促进次生木质部和初生木质部分化。VND7通过诱导木质部半胱氨酸肽1以及死亡蛋白酶的表达诱导PCD执行（图2b）。只有单细胞RNA测序和数学模型的结合才证明VND7足以迫使根细胞通过具有滞后特征的双稳态开关获得木质部细胞特性。当VND7的表达超过阈值时，毛细胞，皮层和内皮层细胞将改变他们的命运。在这些实验之前，人们普遍认为涉及VND7相关的MYB46和MYB83转录因子(TF)激活的前馈回路(FFL) 决定次级细胞壁生物合成酶和PCD执行者的协调转录调控（图2b）。在单细胞测序实验中，MYB83对VND7的诱导没有反应，虽然MYB46对VND7诱导有反应，但它似乎不参与VND7依赖的双稳态开关。对数百个包含VND7表达值动态范围的细胞进行了分析，发现了一组显示双稳态行为的15个基因。这些基因都没有参与VND7-MYB46-FFL。过分别表达VND7、MYB46和MYB83的聚类分析揭示了正在分化的三种木质部细胞亚型的存在（图2c）。虽然两组细胞富含PCD和SCW相关基因，但在具有“混合”特性的细胞群体中观察到早期血管发育基因的富集。还需要进一步的实验来确定这种双稳开关的“执行器”，以及它是如何通过这种新颖的调节电路产生这种双稳开关的。
韧皮部分选细胞转录本的结果说明，MYB 转录因子改变的韧皮部发育(APL)在维持胚后SE特性方面起着关键作用，同时在调节初生韧皮部分化过程中的去核过程中也起着关键作用（图2d）。它还使含有NAC结构域的转录因子nac 45和nac 86这两个下游因子得以鉴定，它们的异位表达足以促进维管细胞的去核和胞浆稀释，而与初生韧皮部分化过程相关的其他特征则不受影响。nac 45/86 TF在调控SE中的分化主要通过分析与初生韧皮部分化相关的形态特征。nac 45，nac86在根初生韧皮部分化细胞中表现出去核延迟，而细胞壁强度保持不变，表明这些细胞仍处于一种未知的发育状态，即分化尚未完全完成。说明对分化的评估不能仅依靠形态特征。将转录组结果与组织学分析相结合，是预测韧皮部细胞发育轨迹上未描述的发育阶段提供了一个完美的工具。
6发育轨迹
细胞类型发育状态的转变也可以通过单细胞测序鉴定（图1c）。由于细胞的真实顺序通常在细胞解离过程中丢失，因此必须指定顺序。此过程称为拟时序分析，并使用降维来对每个细胞相对于其他细胞的关系进行排序。正在经历转变的细胞很可能处于“不稳定”状态，因此处于这种状态的细胞在发育轨迹上会相当稀疏，这可能涉及到反馈机制。单细胞在拟南芥根中的应用已经将表皮和内胚层细胞发育过程中的细胞类型增加到可辨别的数量。
很多方法也可以通过给定的数据估算时间转变的动力。第一种方法是“RNA速度”，通过比较单细胞RNA测序数据的未剪接转录本和剪接转录本的比率来计算转录本的一阶导数。这个比率可以在小时的单位预测单个细胞的未来状态。用这种方法来确定根毛细胞的发育轨迹，并确定了与核内复制的联系。在鉴定维管初始细胞或前形成层细胞向木质部或韧皮部细胞类型的动态转变时，也可以考虑类似的关系。第二种方法，称为URD，除了使用时间有序的单元组的单元格外，还使用基于扩散的模拟计算重建方法确定从最年幼的“根”到最老的“尖端”的拟时间。URD的基础是，在最终时间点分化的细胞会根据表达的变化倾向于形成多个不同的簇，而在早期时间点的原始细胞在表达变化方面往往不太明显。该方法可以用来利用VND7诱导系统或VISUAL维管诱导系统在木质部转分化过程中的命运转变，或者用来表征木质部中柱细胞的发展轨迹，这些细胞开始经历侧根原基的萌生和建立。
7 单细胞测序的潜能及其在分析维管细胞谱系中的局限性
利用单细胞测序技术能够鉴定出正在分化的木质部细胞的三个亚型，那么在初生韧皮部发育轨迹中是否观察到类似的现象？通过单细胞RNA测序和聚类分析可以共同建立转录组图谱，虽然由于初生韧皮部基因的弱表达可能干扰噪声和特异转录本间的区别。这种方法可以揭示与包含两个组织的细胞的发育路径相关的转录组之间的相似性，从而揭示潜在地功能连接的局部细胞生态位，即使它们源自不同的前体细胞。例如，根据发育轨迹结构和表达谱中的相似性识别毛细胞和非毛细胞的前体群体。可以设想鉴定出一种转录上与韧皮部伴生细胞和初生韧皮部分子相似的前体细胞。初生韧皮部衍生的信号，比如韧皮部早期DOF(PEAR)转录因子，促进初生韧皮部分子周围的原形成层细胞沿直线分裂，不仅控制CC的形成，而且在SE周围建立放射状组织中心。遗传或化学抑制初生韧皮部发育不仅抑制了CC的形成，也抑制了与SE接触的细胞的形成，表明初生韧皮部细胞是韧皮部极点的主要组织者。尽管没有初生韧皮部，具有SE形态的细胞仍然出现在中质部的位置，这表明原形成层细胞可以改变它们的细胞命运并获得中质部的特性。URD轨迹分析可以追踪这样的事件。单细胞图谱的分析不仅反映了众所周知的发育阶段，而且也将识别迄今未知的第三种发育状态成为可能。
展望
未来预计单细胞RNA-seq研究将得到一系列其他单细胞分析的补充，包括激素谱、代谢组学和蛋白质相互作用等。单细胞-ATAC -seq，ChIP-seq和DNA甲基化将在动物中实施。另一个挑战将是以丰富的方式显示这些数据，以及确定如何合并从不同平台和算法获得的数据。对于使用单个细胞类型的研究而言，这些问题尚未得到充分解决。单细胞RNA-seq研究的实施正在改变发育过程的研究，为发现新的细胞类型和植物组织的未表征的发育阶段开辟了新的途径。加大测序深度的新技术进展很可能很快就会出现，以克服在研究稀有细胞类型的发育轨迹时遇到的限制。尽管如此，维管领域肯定会从单细胞研究中受益。到目前为止，单细胞测序只适用于拟南芥，在不久的将来将可以描述作物和其他植物物种的维管轨迹。材料成本的下降和改进的细胞分离技术的出现也将使人们能够研究复杂的发育过程，如树木周皮的形成或次生生长。
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