科研 | ISME：转录组研究揭示了海洋硅藻温度适应的分子机制
编译：卡德加，编辑：小菌菌、江舜尧。
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硅藻是海洋初级生产和碳循环的重要参与者，然而其对于温度变化的调节适应机制仍知之甚少。在本研究中，研究者分别对具有耐冷和耐热特性的两种海洋硅藻进行比较转录组分析，结果显示不同特性的海洋硅藻在基准基因的表达上存在一定的进化趋势。研究者认为这种转录层面的变化趋势，是海洋硅藻用于适应不同生长温度的关键机制。在不同的温度环境下，一些特定的如涉及蛋白处理机制、细胞膜结构、重要的短期生理机制等功能通路将被强化或削弱，这也意味着这些通路对于海洋硅藻的温度适应性起到关键作用。研究结果还显示涉及乙酰辅酶A，包括脂质和支链氨基酸代谢等关联通路，同样受到转录调节表现出进化趋势，这些通路也被海洋硅藻用于实现不同生长温度下光合作用中光捕获和代谢变化的平衡。
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实验设计
实验对象为两种角毛藻属(chaetoceros sp.)，分别为CCMP158和CCMP160。CCMP158分离于加拿大圣玛格丽特湾，自1982年起便在14℃的培养环境下生长；而CCMP160分离于法国马赛湾，同样自1982年后生长于24℃的培养环境。在实验开始前，CCMP158和CCMP160分别在16℃和25℃的环境下生活1-2月。随后以6℃-30℃设置6个梯度区间，每组样设置3个重复，观察CCMP158和CCMP160九个世代后的生长情况（CCMP158的观察周期为9-56个世代，CCMP160的观察周期为16-42个世代），生长速率主要通过叶绿素a荧光实验的结果来判断，随后这两种硅藻分别进行细胞组分和转录组分析。当达到最高生长速率时，定义当时的温度为最适生长温度Tmax，生长速率为最高值的50%和86%则分别定义为次适较高温度Tsup和次适较低温度Tsub（图1）。
图1. 角毛藻属CCMP158和CCMP160在不同温度处理下的稳定生长速率
随后每个样取50mL进行生化指标的测定，通过比色法和荧光测定仪等仪器鉴定了叶绿素a、蛋白和RNA的含量。测序平台为Illumina HiSeq 2000，文库片段读长为100 bp的双末端序列，数据过滤采用Trimmomatic。原始数据首先通过Bowtie2比对到PhiX基因组以去除污染序列，随后那些未比对上的reads在进行过滤后，用于后续Trinity软件的de novo组装。随后再次利用Bowtie2，将每个样过滤后的reads比对到Trinity从头拼接组装好的转录组。转录本丰度通过eXpress 1.5.1版本进行估算，随后将那些mapping reads数大于0的基因（3个重复中至少有2个满足此条件）收集，利用DESeq2获得差异表达基因（FDR调整后的p-value < 0.01）。
得到差异基因后，根据它们的表达特点分成9种可能的表达模式（表1）。定义那些仅在冷适应硅藻中且处于次适较高温度，或仅在热适应硅藻中且处于次适较低温度状态下差异表达的基因为潜在强化基因（invested），同理那些具有相反表达模式的差异基因为潜在弱化基因（divested）。通过使用BLAST+、GhostKOALA和TransDecoder等工具，以及现有的KEGG和Swiss-prot数据库，对这些差异基因进行KEGG通路和Brite聚类。这些聚类结果主要涉及代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程等生物学功能。任何一种硅藻中注释结果数量少于10个KO ID的通路将被剔除，并通过超几何分布确定显著富集的KEGG通路（p < 0.05）。
结果
具有冷环境适应的硅藻种（CCMP158，Tmax =16 °C）相较热环境适应硅藻（CCMP160，Tmax = 25°C），具有更慢的生长速率和更低的最适生长温度（Tmax）（图1）。这两类硅藻种在最适生长温度下，表现出光合生理和生化组成的差异，并且这些差异在次适生长温度的条件下（略高于或低于最适温度）同样存在。如NPQ的含量在冷适应硅藻中的含量（0.22-0.3）要显著高于热适应硅藻（0.1-0.16），尽管这种物质在两种硅藻中并未显著表现出含量随生长温度变化的生长趋势。此外，叶绿素a物质的含量在CCMP158中表现出随温度递增的趋势，然而其在CCMP160中并未有此趋势。在最适温度（Tmax）和次适较低温度（Tsub）下，热适应硅藻叶绿素a的相对含量均要高于冷适应硅藻，而在次适较高温度（Tsup）下，该物质含量则差异不大。CCMP160的RNA含量在温度从次适较低温度转向次适较高温度时，发生了显著增长；除此之外，两种硅藻的RNA和蛋白质含量均未有显著变化。在最适温度和次适较低温度下，CCMP160的RNA和蛋白质相对含量均比CCMP158要高。在各自的最适温度下，冷适应硅藻的细胞体积约为热适应硅藻的2.5倍。随着温度的不断降低，CCMP158的细胞体积表现出递增的趋势，然而CCMP160却与CCMP158表现出相反的趋势，尽管这种趋势不具有显著性（p > 0.05）。
4. 与温度适应相关代谢通路的鉴定
讨论
尽管地球上各式各样的生命整体能适应很大区间的温度变化，绝大多数物种自身的适存温度区间却是很狭窄的。一般而言，最适生长温度较高的物种往往有更强的生长速率，过高或过低的生长温度会导致能量代谢、氧化还原反应不平衡等一系列现象，最终引发自身的补偿应答和压力相应机制。研究者通过以两个亲缘关系很接近且最适生长温度存在差异的角毛藻属为研究对象，开展比较转录组分析，以进一步确定与温度适应相关的具体分子机制，以及硅藻生长速率为何随着温度下降而降低的分子基础。
之前有研究显示，当处于低温环境时，蛋白质翻译尤其是核糖体的起始翻译速率均会被抑制，而本研究也表明生长温度能显著影响两种硅藻间涉及翻译和蛋白质合成相关基因的差异表达。在冷适应硅藻中，涉及氨酰tRNA合成、核糖体蛋白、RNA转运蛋白和翻译因子通路的基因均发生上调表达，作者据此认为这可能是为了补偿在更冷环境下翻译速率降低的现象，因此硅藻中的一些基准基因表达可能也得到了进一步增强。此外，涉及tRNA合成的酶基因表达同样得到了强化（表3），这也与氨酰tRNA上调表达的结果相一致。而类似的比较则在热适应硅藻中得到了截然不同的结果，如核糖体生物合成和剪切体相关基因的表达量显著降低。热适应硅藻中核糖体合成功能的弱化，不仅能减少材料和能量消耗，也能缓解多肽处理和内质网的压力，伴侣蛋白和折叠催化分子的表达量提高同样能起到降低内质网压力的作用（表3）。这些与蛋白代谢相关的基准基因的表达差异，对于今后的蛋白组学研究能提供很好的理论支持。
研究者同样针对氮磷比与温度的相关性提出了一些假设。之前的研究显示低温能有效促进浮游生物中磷富集rRNA与氮富集蛋白的比例，进而提高整个海平面的氮磷比。然而，研究者的研究结果显示冷适应硅藻似乎比热适应硅藻有更低的RNA/蛋白比率（表2），作者认为这与热适应硅藻有更高的生长速率有关，从而导致更高的RNA相对含量，而RNA/蛋白的比率似乎并不能直接导致海平面的温度变化。
低温环境会降低蛋白质转换的速率并减少膜的流动性，这一结论通过光合作用蛋白和不饱和脂肪酸生物合成的代偿性上调表达获得证实（表3）。具有寒冷适应性的浮游生物，相较那些具有热适性的物种，似乎有自身独到的策略以应对更慢的蛋白转化速率，如生成更多的光合作用蛋白和更稳定的光合色素等。在本文中，研究者便在冷适应硅藻CCMP158中发现了光合作用PSII类蛋白的增强表达（附表4和附图3），以及更多的叶绿素a和更高的NPQ表达水平，这也表明CCMP158能在处于低温时开启自身的补偿机制，以应对获取能量的减少。此外，不饱和脂肪酸生物合成基因的上调表达能调整脂肪酸在脂质双层中的饱和状态，从而起到动态调节膜流动性的目的。
3. 乙酰辅酶A代谢调控对于硅藻温度适应至关重要
在光合生物中，温度变化能改变代谢平衡，从而影响那些核心代谢物的比例，如NADPH：NADP+和乙酰辅酶A：辅酶A等。研究者在两种硅藻中均发现了脂肪酸代谢的上调表达，以及CCMP160中支链氨基酸（BCAA、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的表达量提高，这表明乙酰辅酶A代谢在硅藻温度适应中起到关键作用。脂质能有效缓解不平衡NADPH：NADP+比例所带来的氧化还原压力，而作为脂肪酸代谢和支链氨基酸代谢通路中的核心物质，乙酰辅酶A的不足会降低细胞分裂的速度，而过高程度的细胞溶质乙酰辅酶A则会导致溶质蛋白的过乙酰化，从而抑制酶活性。作者据此认为脂肪酸和支链氨基酸代谢通路在硅藻环境适应中扮演关键角色。处于低温环境时，脂肪酸的生物合成速率提高，这有助于消耗随着温度降低而增多的乙酰辅酶A和NADPH。而当处于高温环境时，这样的情况又有所不同，光合作用下的碳固定可能不能满足随着代谢活动增强，从而导致的对乙酰辅酶A的进一步需求。从另一个角度来看，增强的组蛋白乙酰化过程将导致细胞内辅酶A的数量不断增加，高浓度时可能导致细胞程序性死亡，而乙酰辅酶A的合成能平衡其浓度，使那些热适应物种保持更高的生长速率。
4. 低温下最大生长速率降低的分子机理
整体来看，具有热适应特性的物种往往具有更高的生长速率，然而生长速率和最适温度之间的分子机理长期以来仍处于未知状态。在冷适应硅藻中，研究者发现细胞周期通路[PATH:ko04141]相关的基因发生上调表达，且绝大多数相关基因与有丝分裂和S期相关（附表3和附图2）。在结果中找到了DNA复制许可因子MCM3（K02541），这个因子是微染色体平衡复合体（MCM complex）的一部分，是在S期DNA复制和起始调控的必需因子。在CCMP158中，这些涉及细胞周期相关的基准基因的低表达，可能在有丝分裂之前延长G2期的持续时间，从而导致CCMP158相对CCMP160更大的细胞容积，这个现象在酵母中也有发现。
为了进一步验证结果，研究者通过现有的海洋真核微生物转录组数据集（MMETSP），模拟分析了这两种海洋硅藻在其最适温度下的差异表达基因。分析结果显示CCMP158中蛋白质合成和光合作用相关基因的表达水平均要比CCMP160更高，这个结果也与之前的分析结果一致（附表5），并且尽管蛋白酶体通路在两种硅藻中均得到了强化表达，CCMP158的表达水平要比CCMP160更高。尽管脂肪酸合成和支链氨基酸的差异表达量在CCMP160中并不显著，但两种硅藻中这些通路的KO ID数量整体是一致的（附表5）。这些结果进一步验证了研究者的假设，即对温度刺激的短期反应具有物种特异性，而温度的变化能有效改变关键基准基因和通路的表达水平，以维持代谢平衡。这些关键通路主要包括氨基酸、碳水化合物、能量和脂类代谢，蛋白质折叠和降解、细胞生长和死亡，以及转录和翻译等（表3）。
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