科研 |CELL STEM CELL：多层空间转录组学鉴定促进人类造血干细胞发育的分泌因子
编译：逍遥君，编辑：景行、江舜尧。
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本研究将主动脉背腹极化信号的空间转录组学分析与分离细胞群体和单个细胞的基因表达谱相结合，以确定人类造血干细胞发育过程中的分泌信号。分析显示，主动脉内皮细胞的一部分具有下调的动脉特征，并与新出现的造血干细胞(HSC)/祖细胞群体存在明显的线性关系。对腹极化分子图谱的分析表明，内皮素1是人类HSCs细胞发育的重要分泌调节因子。所获得的基因表达数据集将为进一步研究造血干细胞在体内发育的机制和体外产生临床相关的造血干细胞提供信息。
论文ID
原名：Multi-layered Spatial Transcriptomics Identify Secretory Factors Promoting Human Hematopoietic Stem Cell Development
译名：多层空间转录组学鉴定促进人类造血干细胞发育的分泌因子
期刊：Cell Stem Cell
IF：20.86
发表时间：2020年9月
通讯作者：Alexander Medvinsky
通讯作者单位：英国爱丁堡大学MRC再生医学中心
DOI号：10.1016/j.stem.2020.08.004
实验设计
结果
1.1 分子信号沿背-腹轴极化
基因集富集分析发现，与V、DL和D相比，VL富集的通路数量异常高。VL富集了神经特异性通路（图1D），与腹外侧定位交感神经节极为相似。其中，V显示转化生长因子β（TGF-β）信号富集。此外，背主动脉壁和较深基质层之间的D-V存在较大差异（图1E），表现为内皮和血管周围标志物在内层高表达，随后中层内皮减少，外层这些标志物进一步减少。
因此，所有背主动脉细胞层均可能促进成人造血系统的腹侧极化发育。此外，尽管在背主动脉深度上存在极化，但V内和V中同心层共享283条通路，表明在发育中的HSC壁龛内具有较强的功能一致性，而相同的背部同心层仅共享37条通路，表明其具有功能异质性。
1.2 肾素和内皮素1是腹侧富集的分泌因子
背主动脉分泌因子是潜在的关键HSC壁龛信号分子。与IAHC形成密切相关的V内富集了目前与HSC发育无关的心脏EGF通路（图1E）。该通路受到分泌因子内皮素1（EDN1）和肾素-血管紧张素通路配体血管紧张素II的刺激。研究发现EDN1、EDNRB和AGTR2有助于V内（与D内相比）和V中（与D中相比）的富集（图2A）。在V内和V中中，EDN1也通过NF-κB促进HSC相关TNF-α信号的腹侧富集（图2B）。EDN1是最显著的分泌因子，呈单调递增的表达梯度，向背主动脉腔内增加（图2C）。值得注意的是，在单调表达从D/DL向V/VL生长的3个基因中，REN1（图2D）作用于血管紧张素II和血管紧张素转换酶（ACE）的上游。此外，V中相比D中，REN是上调最显著的分泌因子（图2E）。肾素和内皮素1均编码血压调节因子，具有相互和交互作用关系。它们同时发生的腹侧富集暗示了在造血微环境中的潜在作用。
图2. 穿过背主动脉壁和周围基质的空间分子极化。（A-B）通过NF-kB的V_Inner与D_Inner“心脏EGF”通路（A）和V_Mid与D_Mid TNF-A信号的富集图（B）显示了贡献基因。（C）LCM-seq2：EDN1的表达水平随着与Ao管腔的距离（LCM-seq2）而降低。（D）LCM-seq1：REN的表达水平从D和DL显著增加到V和VL。（E）V_Mid与D_Mid显著基因的火山图。
2 三个主要EHT群体在EHT谱的基因表达动态
为了绘制EHT（内皮细胞向造血细胞的转变）过程中的基因表达图谱，将来自两个胚胎（CS15-CS16）的主动脉手动一分为二，从腹侧和背侧结构域分选三个细胞群，通过RNA-seq进行谱型分析：内皮CDH5+CD45－细胞（V_Endo和D_Endo）、造血干/祖细胞CDH5+CD45+细胞（V_HSPCs和D_HSPC）和成熟造血CDH5－CD45+细胞（V_Hem和D_Hem）。
2.1 跨EHT的分子信号传导
对V_Endo、V_HSPC和V_Hem中差异表达的TF、分泌因子和细胞表面蛋白进行分析（图3A-3C），观察到：（1）244个基因从V_Endo上调到V_HSPC，然后在V_Hem中下调（如TF GFI1和MYB）；（2）其他基因从V_Endo上调到V_HSPC，并在V_Hem中保持上调（如必需造血转录因子RUNX1和SPI1）；（3）基因在V_Endo和V_HSPC中表达，但在V_Hem群体中下调（如GATA2和SOX18）；（4）与V_Endo和V_Hem相比，V_HSPC群体中一些基因下调（如锌指ZFP36L1和分泌因子A2M））；（5）与V_HSPC和V_Endo相比，V_Hem群体中一些基因上调（例如AFF3以及分泌因子SPP1）。进一步的GSEA将检测到的心室化通路（TGF-b信号、通过NFkB的TNF-a信号和MTORC1）分配给特定的EHT群体。TGF-b信号被分配到V_Endo，MTORC1到V_HSPC群体，TNF-a信号通过NF-kB到V_HSPC和V_Hem群体（图3D）。
图3. 内皮向造血转化（EHT）过程中基因表达的动力学。（A-C）在V_Endo与V_HSPC和V_HSPC与V_Hem中差异表达的TFs（A）、分泌因子（B）和受体（C）相对表达水平的热图。（D）沿EHT的信号模式。（E）LCM-seq1 V_Inner（与D_Inner）和V_Mid（与D_Mid）分泌因子（红色）和V_Endo（与D_Endo）基因（蓝色）之间的相互作用。（F）血液内皮群体内皮素和肾素核心通路基因标准化表达水平的点图。
2.2 生态位相互作用组建模
使用StringDB绘制了分泌生态位因子（V_Inner/Mid）和V_Endo群体中高表达基因之间预测的分子相互作用图（图3E）。EDN1表现出与SPP1和V_Endo TF GATA4的相互作用。SPP1还表现出与V_Endo基因和其他生态位因子的大量相互作用，包括REN（图3E）。这些结果正如预期，V_Inner与V_Endo的Notch受体-配体相互作用比V_HSPC更显著，表明随着EHT进展Notch信号下调。
2.3 内皮素/肾素相互作用信号传导
分选的血液内皮群显示无REN表达或低REN表达，与其在V_Mid中的高表达一致（图3F）。AGTR1/2血管紧张素受体表达较低，而ATP6AP2前肾素受体在所有血管内皮人群中均显著表达，表明肾素通过ATP6AP2发挥作用，与ACE无关。EDN1在内皮群中表达最高，在V_HSPC群中下调到最低，在造血群中中度上调。内皮素激活酶ECE1在所有人群中均有大量表达，在内皮上达到峰值，内皮素受体EDNRA和EDNRB在所有血管内皮人群中均有低表达，但在V_HSPC中表达明显，表明内皮素对EHT有直接作用。
3 单细胞RNA-Seq分析揭示HSPCs的直接祖先
3.1探索血管内皮异质性
为了进一步了解，探索了背主动脉（CS16）的血液内皮异质性（图4A）。对细胞分析后使用Leiden算法产生了20个聚类（图4B）。
可视化基因标记（图4C）可显著提高CL的同一性（图4B）。CL12代表分支为3种不同间充质亚型的细胞：血管周围ACTA2+PDGFRB+CL14和两种未鉴定的亚型，CYP26A1+CL13和SPRR2F+CL15（图4B、4C），还有3种单独的上皮样EPCAM+CL：EMX2+CL17，可能与中肾上皮相关；PERPhiCL18，同一性不明；CL19，仅表达PTH（甲状旁腺激素），成人骨髓中的HSC调节因子（图4B）。小CL20代表POU5F1+NANOS3+原始生殖细胞（PGCs）（图4B）。
CD34和CDH5绘制了10个包含内皮细胞或HSPCs的CL（CL1-CL10）（图4B和4C）。基于分区的图形抽象（PAGA）拓扑树显示了一组相互连接的内皮CL，CL2-CL6（图4D）。这些CL表达静脉标志物APLNR和NR2F2（COUP-TFII），分支内皮CL CL7–CL9也是如此（图4C）。大CL1与中央内皮网络连接较弱，主要表达动脉标志物（GJA5和HEY2），被称为动脉内皮（图4C和4D）。CL9表达红系标记物GYPA和胚胎/胎儿血红蛋白HBE1、HBZ和HBA2，代表原始红系祖细胞（图4C和4E）。
图4.使用单细胞RNA-Seq分析探索血管内皮群体的异质性。（A）单细胞分析的实验策略。（B）CS16 AoV单细胞数据集Leiden聚类的UMAP。（C）识别细胞亚型的关键基因的映射ln标准化表达。（D）基于分区的PAGA拓扑树。（E）（B）中显示的各CL中前3种标志物的平均表达。
3.2 谱系关系分析
邻近内皮网络的两个CL代表造血谱系（CL10和CL11；图4B）。紧贴内皮网络的小CL10是共表达内皮和造血CDH5+PTPRC+（CD45+）决定簇的HSPC群体（图4C），HSPC标记中确定的转录增强子基因NCOA7标记（图3C）。HSPC CL10与更成熟的造血CL11直接相关，同时PTPRC上调和CDH5下调（图4C和4D）。HSPC群体表现出静脉标记物和最小动脉标记物表达（GJA5和HEY2）的下调。力向图还显示了动脉CL1和CL5之间的谱系关系，表明CL5是动脉内皮和造血细胞群之间的“桥梁”群体（图4D）。
CL5的非动脉标记可能反映了HSC成熟所需的coup-TFII介导的Notch信号下调。值得注意的是，CL5富集了与TOP2A、PCNA和CDK1表达升高相关的细胞周期相关通路，这与之前的发现一致。
4 细胞群特异性分辨率暗示自分泌和旁分泌内皮素1作用
为了确定上述检测到的腹侧富集分泌因子的来源群体，所有这些V_Inner/Mid因子（LCM-seq2）被映射到CS16 AoV单细胞数据集中（图5A）。发现造血CL11具有参与成人HSC迁移和增殖的SPP1和补体因子C1QA的最高表达，与V_Hem人群中的表达一致。此外，来自血液内皮分类数据集的顶部腹侧极化内皮基因GATA4和FGF23在内皮CL8中显著表达，表明其在HSC微环境中的潜在意义。
在单细胞数据集中无法检测到肾素-血管紧张素通路的大多数组分，但位于动脉CL1的血管紧张素受体AGTR2和前肾素受体ATP6AP2整体表达除外，尤其是在CL19中较高（图5B）。尽管EDN1广泛定位于内皮中央网络，在CL1、CL4和CL7中的表达特别高且一致，但最强的ECE1（活化酶）表达表明动脉CL1是活性内皮素1的主要来源（图5B）。此外，参与HSC发育和功能的趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在CL1中表达（图5C）。所有这些标志物的共表达表明动脉内皮细胞在HSC微环境中的重要性。内皮素受体EDNRA的表达主要局限于间充质细胞群（CL12-CL15），而EDNRB主要在动脉内皮CL1和造血CL11中表达，与V_Endo和V_Hem组分中的表达一致。因此，来自Ao内皮内衬的内皮素1信号可能以自分泌和旁分泌（间充质和造血）方式发挥作用。值得注意的是，CL1的StringDB相互作用组分析将EDN1置于中心，将其与其他中心信号分子连接：FOS、MMP2、PTGS2和CXCR4（图5D）。
图5. 将LCM-Seq Niche信号映射到AoV中的细胞群提示内皮素1的自分泌和旁分泌信号。（A）在细胞CL的V_Inner和V_Mid亚结构域（LCM-seq1）中检测到的差异表达分泌因子的表达。（B）绘制CS16 AoV单细胞数据集中内皮素和肾素核心通路基因的表达图（该图为ln标准化）。（C）将CXCR4和CXCL12的表达映射到细胞CL。（D）动脉CL1表达基因之间高可信度已知和预测相互作用的StringDB网络，包括直接蛋白质-蛋白质物理和间接功能关联（可信度 > 0.7）。
5 内皮素1表达与IAHCs定位相关
使用RNA-Scope和免疫荧光在RNA和蛋白水平分析EDN1和REN表达模式。尽管REN在[V]+[VL]亚结构域（LCM-seq1）和V_Mid亚结构域（LCM-seq2）中高表达，但仅在腹侧内皮正下方的偶见细胞中检测到（图6A）。然而，沿着从Ao向中肾腹外侧分支的血管观察到较高的REN表达（图6B）。由于受体ATP6AP2的表达，血管内皮细胞是REN的潜在靶标（图3F）。
内皮细胞跨整个D-V轴去pitedn1表达（图6A和6D），部分内皮细胞EDN1探针密度较高，形成信号簇（图6C-6E）。定量测定发现AoV中的EDN1热点显著多于AoD，与分选腹侧内皮中的EDN1富集一致（图6E）。此外，EDN1热点通常位于Runx1+细胞或IAHCs的近端，具有很强的统计学相关性（图6C、6D和6G）。在IAHCs下方也检测到一些较低表达EDN1的间充质细胞，这表明IAHCs附近EDN1高表达可能在HSPC发生中起作用。
值得注意的是，免疫染色在IAHCs中检测到强烈的EDN1蛋白存在（图6F）。假设通过受体结合将外部EDN1蛋白隔离到新出现的IAHCs上。事实上，在IAHCs中检测到低EDNRA水平，与HSPCs中的中度表达一致，此外在间充质中广泛表达。在推测的腹侧迁移神经嵴衍生物中观察到EDNRB强表达（图6D）。一些EDNRB+细胞可以是造血CL10的巨噬细胞。
6 内皮素促进小鼠和人体系统造血发育
研究首先利用小鼠模型研究内皮素信号是否能促进成人型造血。相似的亚型Edn2，腹侧富集在E9.5和E10.5，被纳入功能分析。与人类一样，在新出现的IAHCs近端检测到edn1mrna的腹侧热点。同样，在CD31+cKit+IAHCs上检测到EDN1蛋白（图7A）。在整个主动脉下间充质中也观察到较弱的EDN1染色。为了确定内皮素信号是否可促进成人型造血，使用了概括HSC发育的离体系统（图7B）。在漂浮膜上培养E9.5尾侧组织的再聚集体，并加入其中一种因子REN1、EDN1或EDN2。7天后，在菌落形成（CFU-C）试验中铺板再聚集体。尽管CFU-C总数无显著变化（图7C），但每个因素均显著改变了CFU-C生成，从CFU-Macs变为更不成熟的CFU-GEMM（图7D）。还将再聚集培养物移植到经辐照的Ly5.1小鼠中，并在第8周和第18周评估造血（CD45）再增殖（图7E）。与对照组相比，所有3个因素均增强了外周血、脾脏和骨髓中的长期多系再增殖（图7E）。
然后探讨内皮素对人造血发育的影响。使用了广泛用于模拟造血发育的人胚胎干细胞（hESCs）（图7B）。与小鼠相比，EDN1在人HSC壁龛中存在差异表达。如前所述培养hESCs。在第8天，在诱导生血内皮期间，向单个培养物中添加100 ng/mL EDN1、1 nM EDNRA抑制剂或100 nM EDNRB抑制剂。在4天内，将来自每种培养物的5000个细胞一式两份铺板于甲基纤维素培养物中，并在14天后对菌落进行评分。研究人员发现，与对照培养物相比，EDN1显著增加CFU-C的产生，包括复杂CFU-GEMM菌落的显著增加（图7F和7G），添加EDNRA和EDNRB抑制剂的CFU-C总数的一些减少并不显著。
图7. 内皮素在小鼠和人体模型系统中促进造血。（A）E10.5小鼠胚胎Ao中的CD31、cKit和EDN1免疫染色。（B）小鼠和人体模型系统的实验策略。（C）用10 ng/mL和100 ng/mL的每种试验因子（REN1、EDN1和EDN2）培养的E9.5尾侧组织中CFU-Cs的产生。（D）（B）中CFU-Mac和CFU-GEMM的比例。（E）用试验因子（REN1、EDN1和EDN2）培养的E9.5尾侧部分细胞复制。（F）试验因素对分化12天时人ES细胞产生CFU-Cs的影响。（G）由（E）生成CFU-GEMM。
结论
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END