科研 | Nucleic Acids Res.:非靶向代谢组学分析可识别食物过敏和哮喘的中特定疾病的特征
编译：杨丽军，编辑：Emma、江舜尧。
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过敏性疾病，包括食物过敏（FA）和哮喘，在全世界范围内发病率很高，其中FA的发病率高达8%，仅在美国就有6%的儿童和4%至10%的成年人患病。然而，准确的生物标志物和有效的治疗方法的可用性落后于持续的FA流行，使得不完善的诊断工具，患者避免进食成为主要的治疗选择。过敏性疾病是遗传、表观遗传和环境影响相互作用的复杂病症。虽然过敏性疾病是由它们共同的2型免疫机制来定义的，但它们显著不同的临床表现表明，在形成其异质性表型特征时，还涉及到其他独特的致病过程。对这些致病机制的深入了解可能会导致更加需要改进的生物标记物和新的治疗策略。
非靶向代谢组学分析已成为一种强有力的技术，用于剖析导致复杂疾病的改变途径。非靶向代谢组学能够检测受遗传和环境因素引起的改变使其对于复杂特应性疾病能有效地揭示疾病机制和发现生物标记物。一些研究将非靶向代谢组学应用于哮喘的研究，并确定了与哮喘严重程度和内型相关的代谢特征。相比之下，很少有研究应用非靶向代谢组学来研究FA。一项小鼠研究表明，尿酸代谢与花生过敏有关，这使得作者提出假设推测其在FA发病机制中的作用。最近，一项粪便代谢组学研究表明，肠类杆菌-衍生的鞘脂，特别是脆弱类杆菌-衍生的α-半乳糖神经酰胺与食物致敏儿童的临床FA保护相关，可能是通过调节恒定的自然杀伤T（iNKT）细胞功能。
在这项初步研究中，作者对患有和不伴有哮喘的过敏儿童、哮喘儿童和对照组进行了非靶向代谢组学分析，以更好地确定与每个临床实体相关的代谢变化。这些研究旨在识别与FA存在唯一相关的代谢物，并深入了解疾病发病的潜在机制。结果揭示了与FA相关的独特代谢组学特征，这些特征解释了潜在的病理生理机制。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 研究对象特征
人口统计学和疾病属性总结在表1中。除健康对照组外，其他组中男童的比例略高，但在统计学上并不显著。单纯FA儿童的年龄平均在4.1岁，FA和哮喘的儿童年龄在5.5岁。哮喘儿童平均7.5岁，对照组平均6.3岁。仅单纯FA组和单纯哮喘组患儿的年龄有显著性差异（p<0.05）。观察到种族分布的差异，可能是由于潜在的招募策略造成的，仅哮喘组的非白人患儿的比例略高。与单纯FA的患儿相比，哮喘伴有和不伴有FA的儿童过敏性鼻炎患病率略高。与单纯哮喘儿童相比，伴有或不伴有FA的儿童特应性皮炎的发生率显著增高。大多数FA患儿血清总IgE浓度可用，而伴有哮喘的患儿血清总IgE浓度明显高于FA患儿，在对照组较低。在FA患儿中，30%的受试患者有1个过敏的现象，其余的有2个或以上的食物过敏。在有哮喘和物哮喘的FA患儿中，用肾上腺素治疗的过敏反应相似。
表1 研究人群的特征
2. 整体代谢组学分析
本研究共检测到1165种生物化学物质，868种已知性质的化合物（命名为生物化学物质）和297中结构特征未知的化合物（未命名的生物化学物质）。除去药物代谢物和异种代谢物后，共有773种化合物被纳入分析中。性腺类固醇代谢物水平与年龄密切相关。这类类固醇的差异没有报告，因为它们被认为反映了年龄效应，而不是研究组的真正病理生理特征。
3. FA儿童，哮喘儿童和对照组的比较
对FA患儿和对照组的儿童进行两两分析，发现53中代谢物存在显著差异（如图1）。其中最突出的是脂质代谢产物，尤其是鞘脂和神经酰胺、溶血磷脂、溶酶体原、二酰甘油和脂肪酸。其他代谢物包括氨基酸赖氨酸、苏氨酸和缬氨酸代谢，以及生育酚的β/γ亚型。这53种代谢物的水平在有和没有湿疹的FA儿童之间没有差异，当分析仅限于FA没有湿疹的儿童时，大多数仍与FA显著相关。与哮喘儿童相比，FA患者在两两比较中显示81种代谢物的变化，包括鞘脂、溶血磷脂、单酰甘油和二酰甘油、脂肪酸（单羟基和酰基胆碱）、氨基酸（酪氨酸、色氨酸和组氨酸），胆汁酸和生育酚（图2）。有趣的是，这81种代谢物在比较有无哮喘的FA儿童时没有差异，这表明具有这些重叠过敏表型的儿童获得的代谢组特征与单纯FA的一致，而不是哮喘引起的。与对照组和哮喘儿童相比，FA患儿的9种代谢物异常，包括溶酶体原代谢物1-（1-烯基-棕榈酰）-GPC、溶血磷脂（1-花生四烯酰-GPC、1-亚油酸基-GPC、1-棕榈烯醇-GPC、1-棕榈酰-GPC）、N2-乙酰赖氨酸、β/γ生育酚和鞘磷脂。在FA和单纯哮喘的患儿的比较中，唯一检测到的变化报货次级胆汁酸和芳香族氨基酸（组氨酸、酪氨酸和色氨酸）代谢的变化。
图1 FA患儿和对照组的代谢物热图分析存在显著性差异（p<0.005）
对于每种代谢物，根据顶部所示的比例，每个样品相对表达用比色法表示。代谢物分为主要的失调途径和其他。
图2 FA患儿和哮喘组的代谢物热图分析存在显著性差异（p<0.005）
对于每种代谢物，根据顶部所示的比例，每个样品相对表达用比色法表示。代谢物分为主要的失调途径和其他。
4. FA儿童与对照组比较
哮喘儿童与对照组进行两两比较，共鉴定出51中存在显著性差异的代谢物（p<0.005），影响血浆糖原、磷脂、脂肪酸（单羟基、中链和二元酸）、鞘脂和氨基酸（赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸和苏氨酸）代谢的变化。其中包括先前报道的与哮喘表型和发病机制有关的代谢物，包括氨基酸（苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和谷氨酸）、初级胆汁酸（牛磺胆酸）、脂肪酸（己酸）和磷脂酰胆碱。
5. FA患儿的一个非常明显的鞘脂信号
在FA患儿中，一个特别突出的途径是鞘脂代谢。神经酰胺和鞘脂代谢的步骤如图3所示。这一途径的关键是神经酰胺的合成及其进一步代谢为鞘磷脂和结合性神经酰胺。与对照组和哮喘儿童相比，FA患儿的这条代谢通路中的一些代谢产物减少（图3）。在FA患儿中检测到的大多数变化似乎集中在神经酰胺转化为鞘磷脂、酰基神经酰胺和葡糖酰神经酰胺，而在FA患者中则减少了（图3，A和B）。这一途径的改变也与FA严重程度的特征有关（图3，C和D）。
图3 在FA患儿中，鞘脂的改变是显著的
两组比较FA患儿和有无哮喘喘儿童鞘磷脂（A和C）和神经酰胺（B和D）代谢物，以及FA患儿有或无肾上腺素治疗过敏史。*P<0.05和**P<0.005。
6. FA与循环iNKT细胞的改变无关
iNKT细胞代表一小部分循环NKT细胞，它们携带一个能够识别脂质部分的不变的T细胞受体，包括肠道微生物产生的鞘脂，特别是拟杆菌和脆弱B。外周血iNKT细胞减少与FA有关。我们试图研究与哮喘和对照组相比，FA患儿是否存在iNKT细胞的变化。测定28例FA患者，28例哮喘患儿，15例FA和哮喘患儿以及15例对照组PBMCs中iNKT细胞的比例。各组间NK细胞和NKT细胞比例无差异。虽然哮喘儿童的iNKT细胞比例增加，但FA患儿和对照组之间的iNKT细胞比例没有差异（图4）。
图4 FA患者的循环iNKT细胞没有变化
A.NK、NKT和iNKT细胞的门控策略。FSC，前向散射；SSC，侧散射。B.FA儿童、哮喘儿童、FA和哮喘儿童（FAA）和对照受试者中NK、NKT和iNKT细胞的比例。*P<0.05
7. FA严重程度表型的代谢组学关联
根据诊断出的FAs数量和需要肌肉注射肾上腺素的全身反应史，进一步对FA患儿进行分层。共有41种在不同途径的代谢物在1种食物过敏的FA儿童（n=21）和2种或更多FA的儿童（n=49）之间存在差异。值得注意的是，对1种以上食物有反应的儿童表现出血浆糖原和甘油二酯水平显著升高，在犬尿氨酸和血清素途径中的色氨酸代谢物以及酰基肉碱脂肪酸的水平较低（图5）。与有和无过敏史的FA患儿相比，共有19种代谢物存在显著差异。过敏反应阳性史与较高水平的吲哚色氨酸代谢物和二十烷酸，较低的支链酰基肉碱脂肪酸和鞘脂有关（图5）。有趣的是，FA的严重程度的两个特征都与色氨酸代谢的改变有关。色氨酸是一种重要的芳香族氨基酸，在肠道中受微生物群的直接影响，并通过3条主要途径进行代谢（图5），尽管超过1 种食物过敏的FA儿童表现出犬尿氨酸和血清素途径的代谢物减少，有过敏反应史的儿童表现出独特的吲哚途径增加，这反映在代谢物吲哚丙酸水平显著升高。
图5 在多发性FA和有过敏史的儿童中色氨酸代谢失调
色氨酸代谢的3条途径与两组之间代谢物一起描述，这些代谢物在多发性FA和过敏史儿童中存在显著差异。*P<0.05和**P<0.005。
8. 次级胆汁酸代谢
FA与哮喘患儿胆汁酸代谢存在显著差异（图2）。次级胆汁酸是通过细菌代谢作用从初级胆汁酸中提取出来的，它们反过来调节肠道微生物群的组成。为了确定观察到的由FA引起的胆汁酸组成的差异是否是继发于细菌代谢的改变，我们比较了反映肝脏和肠道酶转化步骤的不同胆汁酸种类的比率。胆汁酸代谢示意图如图6所示。在哮喘患儿中，无论有无FA，胆固醇水平和原发性胆汁酸代谢，包括经典途径和替代途径均未观察到差异。当比较微生物衍生的次级胆汁酸与肝脏产生的一级胆汁酸的比率时，FA儿童表现出替代途径次级胆汁酸熊去氧胆酸（UDCA/鹅去氧胆酸[CDCA]比值）、糖熊去氧胆酸（GUDCA/CDCA比值），牛磺去氧胆酸（TUDCA/CDCA比率）和猪胆酸（HCA/GLCA比率）产生的增加，糖石胆酸（GLCA/CDCA）的生成减少。当测试与胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合相关的酶活性时，FA的存在与经典途径（GDCA/DCA比率）次级胆汁酸中甘氨酸结合降低和替代途径（THCA/HCA比率）中牛磺酸结合增加有关，表明微生物群对初级胆汁酸的加工发生了变化。
图6 A-E，FA患儿与哮喘患儿胆汁酸比率的差异
本研究描述了胆汁酸在肝脏和肠道中代谢的示意图，随后对哮喘儿童和FA儿童的胆汁酸比率进行两两比较。*P < 0 .05 and **P< 0 .005.
9. 通路分析
与对照组相比，FA相关的大多数失调通路包括二氢鞘磷脂、乳糖神经酰胺、溶酶体原、氧化磷酸化、鞘磷脂和己糖基神经酰胺。当与哮喘相比较时，FA相关的失调途径包括肌酸代谢、泛酸和辅酶A代谢、脂肪酸（酰胆碱）和次级胆汁酸代谢。
10. 随机森林分析
FA与对照样本的随机森林分析显示出中等的准确性（70%）。将哮喘与对照样本、FA与哮喘样本相结合，总体预测准确率分别为79%和87%，明显优于偶然发生的50%比率。在FA患儿中，随机森林分类对有和没有哮喘的样本没有预测力，这表明单独患有FA的儿童和FA与哮喘重叠的儿童之间有很强的相似性。生化重要性图显示了FA患儿和对照组受试者比较中的前30种可区分的生化代谢物（图B），表明了膜脂（甘油磷脂酰肌醇和鞘磷脂是最具区别性的）、维生素（γ-和β-生育酚），以及氨基酸（谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸）的主要差异。1-花生四烯酰-GPC是血小板活化因子代谢过程中的一种血浆糖原和前体，是FA的最高预测代谢物。在单独患有FA的儿童和单纯患有哮喘的儿童的比较中（见图B），最具区别的代谢物是维生素/辅助因子（γ-和β-生育酚和泛酸盐）、脂质（甘油磷酸肌醇）和氨基酸/肽（亮氨酸和硫酸半胱氨酸）。
讨论
在这项研究中，对具有不同特应性表型的儿童进行非靶向代谢组学分析，从而确定了与FA相关的代谢组学特征。这一特征在FA和哮喘患儿中占主导地位，可能反应了FA中不同于哮喘和其他潜在的特应性疾病的独特致病机制。鉴于这项研究的试点性质，观察到的特征需要在更大和更集中的群体中进行探索和验证，以梳理出其他因素的影响，比如种族、饮食、微生物群、特定FAs的存在和其他等等。
FA代谢组学的一个特征是脂质代谢物中存在明显的变化，最显著的是鞘磷脂和神经酰胺含量的显著降低。鞘脂是真核生物中一类重要的脂类，从头合成的鞘脂是细胞膜的主要成分，参与多种细胞功能。鞘脂也来源于饮食，可由肠道类杆菌产生。据报道，血浆鞘脂的变化与严重的过敏性呼吸反应有关。在最近的一份报告中，与临床FA患者或对照组相比，食物过敏儿童粪便中检测到更高水平的鞘脂蛋白。iNKT细胞识别非典型MHCI类分子CD1d呈现的脂质配体，包括类杆菌物种衍生的鞘脂。在后一项研究中，粪便鞘脂对食物致敏儿童的体外iNKT细胞激活增加，而FA儿童则没有。据报道，牛奶过敏儿童的iNKT细胞数量减少，脱敏后增加，表明了iNKT细胞在FA患者中的作用。然而，我们没有发现FA患儿与对照组有iNKT细胞的差异，哮喘患儿的iNKT细胞比率出现了微小而显著的增加，这与之前的结果一致。
在FA患者中观察到的鞘脂变化表明神经酰胺的生成减少，并且在神经酰胺转化为鞘磷脂过程中额外的远端步骤减少，可能是由于鞘磷脂合成酶和鞘磷脂酶作用。鞘脂代谢的这一步已在TH17细胞分化中被发现，表明这一途径在调节T（Treg）细胞/TH17细胞与FA相关的免疫调节作用。而且，ORMDL3的蛋白产物（一个与哮喘易感性高度相关的基因）通过抑制从头合成鞘脂来调节鞘脂代谢。这一结果表明，鞘脂稳态在肺过敏性炎症中骑着关键作用，为治疗干预提供候选疾病生物标记物和潜在靶点。本文研究结果同样表明，FA患者的鞘脂代谢中有一个意想不到的潜在的重要作用，而且鞘脂代谢物作为疾病生物标志物的潜在用途。
FA患儿表现为其他种类的脂质减少，包括溶血磷脂和脂肪酸，如单酰甘油和二酰甘油。最近观察到溶血磷脂的水平，特别是在FA小鼠模型中的血浆素水平也有类似的降低。值得注意的是，血小板活化因子代谢物前体1-花生四烯酰-GPC与FA呈强负相关性，这与最近的报道一致，即血小板功能改变可能在严重食物诱发呼吸过敏反应患者中起作用。这些观察结果强烈表明，脂质改变在FA发展过程中起关键作用，需要进一步的研究。某些氨基酸（赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸）和维生素E的代谢失调也与FA有关。
微生物组的变化与过敏性疾病有关，包括FA和哮喘。最近在小鼠和人类受试者的FA发病机制中发现了生物失调的关键作用。微生物群可通过多种机制影响宿主，包括通过分泌代谢物。在作者的研究中，患有FA和哮喘的儿童在肠道内通过厌氧菌作用产生的次级胆汁酸的比例有明显差异。特别的是，观察到替代胆汁酸熊去氧胆酸及其结合物的生成增加，以及传统途径和替代途径中牛磺酸/甘氨酸结合率也有显著差异。作者的发现不仅支持FA和哮喘患儿的生物失调作用，而且表明微生物诱导的代谢产物的差异特征可以在不同的过敏表型中检测出来，并且可以作为疾病的标志。此外，次级胆汁酸激活肠道和其他组织中表达的胆汁酸受体，以调节局部和全身反应，包括炎症和先天性免疫反应。胆汁酸的变化与炎症性疾病的发病机制有关，次级胆汁酸代谢失调的长期影响可能存在于FA患儿中。当比较FA和哮喘儿童时，我们观察到两种情况下的儿童代谢组学特征与单独患有FA的儿童重叠。这项观察表明，FA的存在提供了一种反映FA致病机制的代谢组学特征，FA在哮喘的共同存在中占主导地位。与不同的疾病机制相一致的是，有报道称FA是哮喘恶化的独立危险因素，包括症状的频率和严重程度。这些结果表明，在不同的过敏性疾病中，可能影响疾病表现的机制之间存在协同作用。
FA患者可表现出严重的表型，表现为多发FAs、危及生命的全身反应，或两者兼而有之。有过敏史的儿童中观察到鞘脂代谢物的变化（图3）。鞘脂对肥大细胞有重要的调节作用，鞘氨醇-1磷酸酯作为阳性调节因子，由高亲和力IgE受体与鞘磷脂和神经酰胺代谢物通过抗原特异性交联后分泌。在FA患儿中观察到的鞘脂和神经酰胺水平的显著降低可能反应了肥大细胞对易发生严重过敏反应的高反应状态。多FAs和过敏反应的阳性病史与特定的代谢改变有关，包括促进口服耐受的代谢改变，最显著的是必需的芳香族氨基酸色氨酸和短链脂肪酸。色氨酸通过3种不同的途径代谢：（1）通过肠道微生物群直接转化为吲哚代谢物，从而激活芳基烃受体；（2）通过2,3-双加氧酶-1的作用在免疫细胞和上皮细胞中形成犬尿氨酸途径；（3）通过Trp羟化酶-1在肠嗜铬细胞中产生5-羟色胺。发现多发性FAs患儿的犬尿酸和5-羟色胺途径中的代谢物水平降低，有过敏史的儿童芳香烃受体配体吲哚丙酸显著增加。犬尿氨酸和吲哚途径在黏膜屏障（包括Treg细胞）的免疫反应中都很重要，并有助于肠道内稳态。同样，短链脂肪酸影响Treg细胞归巢和屏障界面的稳定性。因此，作者的发现表明FA患儿，耐受性代谢途径的一场可能是疾病严重程度的决定因素。
作者研究的一个关键优势是招募患有1种或重叠性特应性疾病（FA、哮喘、FA和哮喘）的患者。医生根据最近出现的IgE介导症状和基于IgE的阳性检测结果对食品进行了FA诊断。这种方法消除了与FA症状自我报告相关的已知偏差，这些偏差已被证明与医生对FA的诊断没有充分的相关性。另一个优势是疾病严重程度信息的可用性，这使得FA的严重程度和特定代谢途径的变化之间首次有了关联。同时也存在一定的局限性，这是由于它的试点性质。样本量相对有限。通过应用最大显著性水平（P<0.005）来报告研究组之间的差异来解决这一限制。未来需要更大样本量的研究来验证作者的发现，以及进行亚组分析。
患有FA的儿童饮食受到限制，这可能反过来影响他们的代谢组学特征。为了解决这一问题，研究人员将患有不同脂肪酸的儿童纳入研究范围，以抵消个别食物回避的影响。尽管饮食习惯可能仍然会影响FA患儿的代谢变化，在研究中检测到的许多变化涉及到与饮食摄入没有直接关系的代谢物，需要确定饮食限制对FA患儿代谢组的影响程度。
总之，本文研究建立了与FA和疾病严重程度相关的独特代谢组学特征。他们还揭示了有哮喘和无哮喘的FA儿童的代谢组学特征的一致性，这表明FA患者无论是否存在哮喘，都存在不同的疾病机制，与哮喘无关。观察结果表明，代谢组学分析可以作为一个强有力的方法来提高对FA发病机制的认识，并且是识别候选生物标志物和治疗干预靶点的有用工具。