科研 | J. Allergy Clin. Immunol：NSAID加重性呼吸系统疾病中炎性巨噬细胞记忆
编译：孙元芳，编辑：Emma、江舜尧。
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非甾体抗炎药(non-steroidalanti-inflammatory drug, NSAID) 加重性呼吸系统疾病(N-ERD)是一种由花生四烯酸(AA)代谢异常驱动的慢性炎症状态。巨噬细胞是AA代谢物的主要产生者和代谢重编程者，但它们在N-ERD中被忽视。本研究试图阐明N-ERD中潜在的代谢和表观遗传学上的巨噬细胞重编程。本研究通过RNA测序、海马分析和LC-MS/MS对N-ERD患者和健康对照组巨噬细胞的转录、代谢和脂质介质谱进行了评估。基于靶向代谢组学分析，对N-ERD患者(n=15)和健康个体(n=10)的鼻粘膜液、痰液和血浆中的代谢物进行量化。利用全基因组甲基化组学揭示N-ERD巨噬细胞重编程的表观遗传机制。我们发现N-ERD患者的单核细胞/巨噬细胞表现出DNA甲基化的整体降低、异常代谢谱和趋化因子表达增加，表明持续的促炎症激活。N-ERD巨噬细胞中的差异甲基化区域包括与趋化因子信号转导和无环鸟苷代谢有关的基因。靶向代谢组学分析发现N-ERD患者巨噬细胞、痰液、鼻粘膜液和血浆中的乙酰肉碱含量升高。与健康巨噬细胞相比，在炎症激发时，N-ERD巨噬细胞产生的酰基胆碱酯酶、促炎性AA代谢物、细胞因子和趋化因子水平升高。总之，本研究破解了N-ERD中巨噬细胞的促炎代谢和表观遗传重编程。因此，巨噬细胞持续的促炎性激活是N-ERD的病理机制和治疗靶点。
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实验设计
实验结果
1. N-ERD患者表现为持续的促炎巨噬细胞活化
通过炎症刺激重新编程或“训练”的单核细胞源巨噬细胞(MDM)可以控制2型炎症期间呼吸道的免疫反应。为了确定N-ERD中潜在的巨噬细胞重编程，我们进行了肺泡样单核细胞源巨噬细胞(aMDM)的RNAseq分析，该细胞不同于N-ERD患者和健康个体的CD14 +血液单核细胞(TGF-β1 and GM-CSF)。尽管进行了一周的体外分化，但与健康的aMDM相比，在N-ERD中发现了86个下调基因和19个上调基因(图1A)。通过功能和途径分析(图1A-C)显示，上述基因包括趋化性基因(CXCL1-3，PPBP，CXCL8，CCL18，CCL20)和宿主防御相关基因(CD1A-C，CLEC10A，CLEC18B)，提示N-ERD与单核细胞/巨噬细胞的持续促炎性激活有关。
为了进一步研究N-ERD患者呼吸道中是否存在促炎性巨噬细胞，将N-ERD患者的痰源巨噬细胞(sMac)用于转录组分析。为了了解局部和全身巨噬细胞的活化情况，我们比较了同一N-ERD患者的痰源巨噬细胞和血液单核细胞源巨噬细胞。RNAseq显示，与aMDM相比，sMac中共有984个基因下调，1869个基因上调(图1D)。富集和通路分析显示，大多数差异表达基因(DEGs)与宿主防御和免疫调节相关(图1E)。N-ERD患者的sMac表现出与趋化(CXCL1-3、8,9、CCL18、20)、免疫调节(IDO1、IL10、IL23A、IL27、SCGB1A1)、T细胞启动(HLA、CD28、CD40、CD80)和宿主防御(TLR2、5,10、CD1A-C)相关的基因高表达，提示与aMDM相比，sMac具有更活跃的表型(图1F)。我们还发现了独特的类花生酸基因表达特征，aMDM中为ALOX5AP，CYSLTR1，LTA4H，PTGS1，PTGDS，sMac中为ALOX15，CYSLTR2，PTGS2，HPGDS，PTGER2-3，PTGES。这表明在aMDM类花生酸分析以白三烯(LT)为主，在sMac中类花生酸分析以15-脂氧合酶(LOX)/ 环氧酶(COX)为主(图1F)。尽管健康个体中可收集的sMac数量很少，无法将N-ERD 患者sMac与健康sMac进行比较，但本研究结果仍可以表明N-ERD患者的血液和呼吸道中存在具有持续促炎表型的单核细胞和巨噬细胞。
图1 N-ERD患者的巨噬细胞表现出促炎基因表达谱(A-C)为N-ERD患者(n=5)和健康志愿者(n=4)的aMDM的转录组分析
(A)为差异表达基因的火山图，蓝色显示的为显著下调的基因，红色显示的为显著上调的基因，阈值设置为纠正P 值小于0.05, log2 (FoldChange)大于+1或小于-1。(B)为ToppGene分析得到的10个重要通路。(D-F)为N-ERD患者(n=5)的aMDM和sMac的转录组分析。(D)为差异表达基因的火山图，蓝色显示的为显著下调的基因，红色显示的为显著上调的基因，阈值设置为纠正P 值小于0.05, log2 (FoldChange)大于+1或小于-1。(E)为ToppGene分析得到的13个重要通路。N-ERD患者与健康个体(C)或细胞类型(F)之间的选定DEG(z评分)的热图。
2. N-ERD巨噬细胞表现出的促炎介质和代谢物特征
基于N-ERD巨噬细胞的促炎基因表达谱，我们比较了健康，患有鼻息肉的慢性鼻窦炎但耐受NSAID的患者(NT CRSwNP)和N-ERD患者通过aMDM产生的介体。在基线时，与健康的aMDM相比，N-ERD aMDM仅表现出趋化因子分泌增加的弱趋势(Fig. 2A)。由于多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢异常是N-ERD的标志，我们进一步研究了在我们的N-ERD队列中痰液、鼻内膜液或巨噬细胞中PUFA代谢产物是否发生改变。事实上，我们通过LC-MS/MS证实了N-ERD患者呼吸道中LT-升高而PGE2生成降低的趋势(图E1)。为了研究N-ERD患者的aMDM是否表现出产生二十烷醇的改变能力，我们通过LC-MS/MS在Ca2+离子团(A23187)刺激后评估PUFA代谢产物的水平。与NT CRSwNP患者aMDM相比，N-ERD患者aMDM中产生了更多的AA衍生的5-LOX代谢产物(5-HEPE / -HETE /-oxoETE，LTB4)和二十二碳六烯酸的自氧化产物(DHA；11-HDHA，13-HDHA)(Fig. 2B, C)。在N-ERD患者aMDM中，半胱氨酰LTs(cysLTs)，PGD2和血栓烷B2(TXB2)的合成增加，但不明显。因此，除了独特的促炎基因表达谱外，来自N-ERD患者的巨噬细胞还显示出释放PUFA代谢产物的能力增强，构成了N-ERD患者中的促炎类花生酸谱。
图2 来自N-ERD患者的单核细胞源巨噬细胞产生促炎性介质的能力增强
(A) 通过多重细胞因子阵列确定的N-ERD患者(n = 15)，NT CRSwNP患者(n = 10)和健康(n = 8)的aMDM产生的趋化因子含量的热图；(B)和(C) 基于LC-MS / MS定量，N-ERD患者(n = 13)，NT CRSwNP患者(n = 10)和健康(n = 10)的aMDM产生的类花生酸的热图(B)和柱状图(C)。自动缩放的浓度显示为z分数，蓝色(低)或红色(高);没有检测到表示为ND。数据以平均SD表示。*p < 0.05(Kruskal-Wallis与Dunn s多重比较检验)。
3. N-ERD患者巨噬细胞显示出独特的DNA甲基化以及趋化因子和脂质代谢基因的表达
由于N-ERD患者 aMDM的基因表达改变和类花生酸的产生在体外分化7天后仍然存在，我们接下来研究这些变化是否与表观遗传修饰相关。
CD14+单核细胞分化为aMDM导致造血相关基因(INPP5A, GPR171)甲基化增加，调控巨噬细胞募集和效应功能的基因(HDAC5, IL7R, TGM2)被去甲基化。无论是健康人还是N-ERD患者，单核细胞和aMDM都是按照细胞类型聚集的，表明N-ERD患者的单核细胞向aMDM分化正常。然而，当比较N-ERD和健康个体的aMDM时，我们发现了3930个低甲基化差异位置(DMPs)和211个高甲基化差异位置 (图3A)。这代表了N-ERD患者中整体转录预活化巨噬细胞表型。
aMDM和单核细胞显著差异甲基化区域(DMRs)的功能分析显示，趋化性(CXCL2, PF4 (CXCL4))和脂肪酸/酰肉碱代谢(CPT1A, CPT1B,ACACA)与N-ERD相关(图3B, C)。尽管在基线时，N-ERD患者和健康个体在aMDM中CPT1A、CPT1B和ACACA表达水平相似(图3D)，但受到乙酰肉碱混合物刺激时，N-ERD aMDM中CPT1A的表达水平明显高于健康aMDM(图3E)。综上所述，这表明N-ERD巨噬细胞持续的促炎激活至少部分是由脂肪酸/酰肉碱代谢相关的代谢和表观遗传变化引起的。
图3 N-ERD患者巨噬细胞在参与细胞募集和酰肉碱代谢的基因中表现出不同的DNA甲基化
(A)N-ERD (n = 15)与健康(n = 8) aMDM的差异甲基化位置(DMPs)火山图；显著变化用蓝色(下降)或红色(上升)表示；阈值设置为校正后P值小于0.05；(B) N-ERD与健康的aMDMs中显著差异表达基因(DEGs)和差异甲基化区域(DMRs)以及单核细胞的差异甲基化区域的韦恩图；(C)ToppGene分析得到的9个重要分子功能；(D)基线时，非饥饿N-ERD患者(n = 14-15)和健康(n = 10)aMDM中CPT1A，CPT1B和ACACA的相对表达量；(E)aMDM(n=5 N-ERD，n=6健康人)在含有0.25%FBS的完全培养基中饥饿5小时后，再用LPS(10 ng/mL)、乙酰肉碱C14(10μM)、C14-、C16-和C18肉碱混合物(均为10μM)+/-LPS(10 ng/mL)刺激19 h后，aMDM中CPT1A、CPT1B和ACACA的相对表达量。
4. N-ERD患者的上呼吸道和下呼吸道的乙酰肉碱含量增加
由于上述甲基化组学和RNAseq数据表明代谢变化在N-ERD巨噬细胞促炎重编程中发挥作用，我们通过靶向代谢组学对N-ERD患者、NT CRSwNP患者或健康对照的鼻粘膜液和痰中的脂质、氨基酸和碳水化合物代谢谱进行了表征。利用层次聚类方法，在鼻粘膜液中发现了四种不同的代谢物簇(Fig. 4A)。最突出的簇1与N-ERD有关，以高浓度的乙酰肉碱、溶血磷脂酰胆碱和组胺为特征。至于痰液，分层聚类产生了三个主要的代谢物聚类，其中含有乙酰肉碱代谢物的聚类2与N-ERD相关(图4B)。因此，N-ERD的特征是呼吸道中乙酰肉碱水平升高。
5. 与N-ERD相关的是血浆乙酰肉碱和鞘脂，而不是脂肪因子
为了研究N-ERD患者中代谢物谱的局部变化是否能被系统地反映，我们对健康人、NT CRSwNP患者和N-ERD患者的血浆进行了代谢组学分析。鞘脂以前被认为是N-ERD的潜在生物标志物，因此本研究进行了鞘脂靶向鞘脂代谢组学。分层聚类将三组患者分成5个部分重叠的聚类(图4C)。簇1和簇2主要由健康对照中水平较高的氨基酸组成，而簇3和簇4的特征是含有在NT CRSwNP患者和N-ERD患者中浓度均较高的鞘磷脂和鞘磷脂-1-磷酸(S1P)。与N-ERD相关的第5簇含有鞘磷脂和长链酰肉碱(C12- C16)(图4C)。进一步的途径分析显示鞘脂代谢与N-ERD相关，尽管个体代谢物没有显著差异。因此，N-ERD的特征是局部和全身的乙酰肉碱和脂质信号异常，这表明该病中脂质代谢存在广泛的失调。
由于在肥胖引起的炎症中乙酰肉碱增加，并且BMI增加被认为是N-ERD的危险因素，我们评估了BMI及其与临床症状评分的潜在相关性。此外，我们量化了与肥胖、哮喘和NT CRSwNP相关的脂肪因子。然而，N-ERD患者的BMI和瘦素均无显著增加，且BMI、脂肪因子和SNOT-22评分之间无相关性(r = 0.25, p = 0.37)。相比之下，与巨噬细胞的促炎活化有关的脂联素在N-ERD患者的血浆中较健康人和NT CRSwNP患者有所升高。
6. 基线和炎症激发后，N-ERD患者巨噬细胞中的乙酰肉碱含量增加
由于乙酰肉碱参与了巨噬细胞的促炎活化，我们研究了N-ERD巨噬细胞内的乙酰肉碱水平是否改变。事实上，与健康的aMDM相比，N-ERD患者aMDM中大多数的乙酰肉碱种类趋于升高(图4D)。此外，部分乙酰肉碱种类在LPS刺激下进一步升高，提示炎症条件下巨噬细胞乙酰肉碱代谢的畸变可能加重(Fig. 4D, E)。
图4 多体液的代谢组学鉴定了N-ERD患者局部、全身和细胞内乙酰肉碱代谢的改变
从健康人群(n = 8/3/9)、NT CRSwNP患者(n = 8/0/10)或N-ERD患者(n = 11/5/12)中提取的鼻粘膜液(A)、痰(B)和血浆(C)的多液代谢组学。(D-E)健康人群(n = 6)和N-ERD患者(n = 5) aMDM+/- LPS(10 ng/mL)后细胞内乙酰肉碱水平。
7. 在LPS刺激下N-ERD患者巨噬细胞显示炎症基因表达增加，但生物能重编程无影响
为了研究乙酰肉碱潜在的促炎作用，我们用肉豆蔻酰-L-肉碱(c14 -肉碱)刺激aMDM，此前有报道称肉豆蔻碱可诱导小鼠单核细胞系炎症基因的表达。然而，在人aMDM中，c14 -肉碱单独不能诱导炎性细胞因子(IL1B或TNFA)、趋化因子(CXCL2、CXCL8)或COX-2 (PTGS2)的表达(Fig. 5A)。相比之下，单独使用LPS或与c14 -肉碱联合使用均能有效诱导这些基因。值得注意的是，在LPS刺激下，N-ERD巨噬细胞对CXCL2、IL1B、PTGS2和TNFA的诱导显著增加，表明其对炎症反应的反应增强(Fig. 5A)。由于炎症刺激(如LPS和葡聚糖)的反应性增强与生物能量重编码有关，我们进一步进行了代谢通量(海马)测定，以评估N-ERD巨噬细胞是否表现出改变的生物能量谱。基线时，N-ERD患者aMDM的细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)与正常aMDM没有差异，表明糖酵解和线粒体呼吸没有发生重大变化(Fig. 5B-D)。然而，当C14-肉碱加LPS刺激时，健康个体的aMDM，而非N-ERD患者aMDM显示出线粒体呼吸和糖酵解显著增加。因此，N-ERD患者aMDM并不是通过增加呼吸和ATP的产生来回应炎症刺激，而是倾向于增加促炎效应分子的表达。
图5 N-ERD患者巨噬细胞对LPS的反应增强，但对C14-乙酰肉碱无反应
(A-D)aMDM(健康(n=6)或n-ERD(n=4-6))在完全培养基(0.25%FBS)中饥饿5小时后，再用LPS(10 ng/mL)、C14-乙酰肉碱(10μM)或两者的组合刺激19 h，aMDM(健康(n=6)或n-ERD(n=4-6))的相对基因表达(A)、耗氧率(OCR)或细胞外酸化率(ECAR，B-D)。
8. N-ERD患者巨噬细胞M2异常活化
由于2型炎症通常与巨噬细胞的M2极化有关，我们进一步分析了N-ERD患者aMDM在基线和炎症激发时的M2标记物。在N-ERD患者aMDM中，参与促分解介质合成的ALOX15趋于减少，而促炎M2标记物(CCL17和TGM2)趋于增加(Fig. 6A)。在N-ERD患者aMDM中，LPS刺激导致M2标记基因(ALOX15、MRC1、TGM2)减少更为明显(Fig. 6B)。然而，在LPS+C14-肉碱的刺激下，N-ERD患者aMDM中促Th2的趋化因子CCL17的上调加剧(Fig. 6B)。因此，N-ERD患者aMDM表现出广泛的促炎表型转变，并且可能在发炎或感染性攻击期间加剧呼吸道发炎。
图6 N-ERD患者的巨噬细胞M2异常活化
(A)在完全培养基(0.25%FBS)中饥饿5小时的aMDM(健康(n=6)或n-ERD(n=5))基线下M2标记物ALOX15、CCL17、MRC1和TGM2的相对基因表达；(B) aMDM(健康(n=6)或n-ERD(n=4-6))在完全培养基(0.25%FBS)中饥饿5小时后，再用LPS(10 ng/mL)、C14-乙酰肉碱(10μM)或两者的组合刺激19 h，ALOX15、CCL17、MRC1和TGM2的相对基因表达量的变化倍数。
讨论
慢性2型炎症性呼吸道疾病，包括非甾体抗炎药加重性呼吸系统疾病(N-ERD)仍然是主要的急需解决的临床问题。巨噬细胞在2型炎症中起着关键作用，但在人类患者中决定巨噬细胞表型和功能的代谢和表观遗传程序仍在很大程度上不为人所知。本研究发现患有N-ERD的患者具有空前的促炎性巨噬细胞记忆，N-ERD是一种严重且对治疗有抵抗力的慢性呼吸道炎症。转录组学(RNAseq)、甲基化组学和多体液靶向代谢组学(LC-MS/MS)分析显示，N-ERD患者单核细胞源巨噬细胞中存在不同的基因表达、DNA甲基化和代谢物谱。特别是，N-ERD巨噬细胞产生更高水平的促炎脂肪酸代谢物(酰基肉碱和5-LOX产物)以及上调趋化因子和细胞因子。令人惊讶的是，即使在体外分化7天后，N-ERD巨噬细胞的促炎能力仍明显增强。因此，我们的研究确认巨噬细胞的持续代谢和表观遗传重编程是慢性2型炎症的一种病理机制。我们将肺泡样单核细胞源巨噬细胞（aMDM）用作体外模型，因为GM-CSF和TGFβ1对肺泡巨噬细胞的分化至关重要，并且aMDM与肺泡巨噬细胞具有同等重要的特征。确实，在炎症过程中，单核细胞和MDM高度相关，因为单核细胞会渗入呼吸道，而骨髓中的髓样祖细胞可以进行功能性重新编程，并影响炎症信号。本研究表明，这种现象被称为“中央训练的免疫”，也可能导致N-ERD患者的慢性2型呼吸道炎症。
最近的研究表明，在过敏性哮喘的小鼠模型中，较高水平的乙酰肉碱与脂肪酸氧化增加（FAO）和呼吸道炎症有关。在本研究中，我们还发现N-ERD患者巨噬细胞和体液中的乙酰肉碱水平升高，表明这些代谢物参与了2型炎症。但是，乙酰肉碱代谢的改变本身并不是慢性气道炎症的迹象，因为NT CRSwNP患者体内乙酰肉碱没有改变。再加上先前报道的花生四烯酸和鞘脂代谢异常，这表明脂肪酸代谢在N-ERD中更加失调。尽管N-ERD患者体液中代谢物的改变可能是由于多种细胞类型的代谢变化引起的，但我们的研究结果验证了炎症过程中巨噬细胞在产生酰基胆碱酯酶和促炎性5-LOX代谢物中的作用。事实上，N-ERD患者的巨噬细胞表现出高效产生促炎性5-LOX产物（包括LTB4和5-oxo-ETE），促进嗜酸性粒细胞活化和招募。因此，巨噬细胞与粒细胞和肥大细胞一起可能是N-ERD中致病性5-LOX代谢物的重要来源。
除了能够产生5-LOX代谢物外，N-ERD患者aMDM还表现出多种促炎趋化因子的表达增加。结合PTGS2的高表达表明基线状态下N-ERD巨噬细胞已经处于预激活、促炎状态。与健康对照组相比，在LPS的炎症激发下，N-ERD巨噬细胞表现出更明显的促炎基因表达上调。然而，N-ERD患者aMDM中多种促炎效应分子上调的同时，潜在宿主保护分子（CD1a-c，CLEC10/18A）显著减少。这可能导致巨噬细胞清除病原体的缺陷，这被认为是哮喘慢性加重的重要机制。此外，CD1分子的下调代表了一种促进病毒持续存在的免疫逃避机制。因此，N-ERD患者aMDM的基因表达谱表明巨噬细胞处于促炎但潜在的功能失调的激活状态。事实上，先前的一项研究表明，NN-ERD患者是多发性哮喘恶化风险最高的患者之一。然而，这是否是N-ERD中巨噬细胞异常激活的结果仍有待研究。
N-ERD患者aMDM在体外分化7天后仍表现出明显的基因表达特征，这表明这些细胞具有表观遗传重编程能力。全基因组甲基化分析显示N-ERD特异性甲基化信号在单核细胞-巨噬细胞分化过程中稳定。然而，N-ERD和健康单核细胞/巨噬细胞之间的DNA甲基化差异相对较小，这表明的进一步的表观遗传机制（如组蛋白修饰）可能有助于鉴定基于RNAseq的促炎基因表达谱。在基线时，N-ERD患者aMDM仅表现出其产生促炎趋化因子能力的适度增加。因此，N-ERD巨噬细胞的促炎潜能只有在炎症激发后才能在外周组织（如鼻粘膜或肺）中充分发挥。
不幸的是，健康个体中回收的痰源巨噬细胞数量少，无法对N-ERD患者和健康对照者的呼吸道巨噬细胞进行比较。但与既往研究一致的是，与aMDM相比，痰中巨噬细胞表达丰富的促炎趋化因子(CXCL8/9/10/11)、抗原提呈分子、免疫调节酶(IDO-1、COX-2、mpgs -1)、双向调节蛋白和SCGB1A1。可能是N-ERD患者呼吸道中活跃的2型炎症的结果，导致sMac也富含M2激活标记物（IRF4、CCL17、IL4I1、ALOX15、HPGDS）。
重要的是，在我们的研究中，N-ERD患者和NT-CRSwNP患者的整体疾病状况、组织成分和代谢物可能受到鼻内和/或吸入皮质类固醇以及哮喘的影响，而且哮喘更容易影响N-ERD患者。未经治疗的患者的样本可能会为N-ERD期间成熟的巨噬细胞活化提供潜在的见解，但由于N-ERD的症状严重，此类研究难以实现。基于德国的探索性设计和严格的安全性规则，我们研究的弱点是队列规模相对较小和缺乏证实性非甾体抗炎药刺激。因此，未来的研究应该在更大的N-ERD队列中验证我们的发现，优先选择NSAID刺激后确诊为N-ERD的患者。这些研究将有望进一步阐明巨噬细胞重编程作为N-ERD的病理机制。此处描述的炎性巨噬细胞记忆也有助于解释该疾病的获得性或延迟发作。最后，我们的工作为2型炎症中的免疫细胞重编程提供了前所未有的见解，这可能与多种慢性呼吸道疾病有关。
结论
本研究报道了非甾体抗炎药（NSAID）加重性呼吸系统疾病患者的巨噬细胞在代谢和表观遗传学上发生了重组，导致炎症刺激反应性增强，促炎性脂肪酸代谢物和趋化因子的产生增加。