科研| Theranostics：宏基因组和代谢组学分析揭示了不同严重程度的慢性肾脏疾病中肠道微生物特征
编译：Mendelsohn，编辑：谢衣、江舜尧。
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慢性肾脏病(CKD)是一种严重的疾病，与肠道菌群和循环代谢的特定变化有关。然而，CKD微生物的功能与疾病不同阶段宿主代谢的复杂关系尚不清楚。在本研究中，纳入不同严重程度CKD患者和非CKD的对照者，对粪便样本进行宏基因组鸟枪测序以及对血清胆汁酸、短链和中链脂肪酸以及尿毒症溶质进行靶向代谢组学分析。结果显示，13种微生物和6种循环代谢物的水平在CKD早期至晚期不同阶段或仅在特定阶段有显著变化。其中，Prevotella sp. 885(降低)与尿素排泄有关，而己酸(降低)和对甲酚硫酸盐(升高)与肾小球滤过率分别呈正相关和负相关。此外，我们还发现了与循环代谢物变化相关的肠道微生物种类。在CKD早期阶段与次级胆汁酸合成相关的微生物基因表达丰富,而在CKD终末期与脂质代谢和脂多糖生物合成相关的信号通路分子则表达丰富，表明微生物代谢的变化和宿主炎症可能加重肾脏疾病。此外，我们还鉴定了宏基因组和代谢组学标志物，以区分不同严重程度的CKD病例与正常对照组，其中Bacteroides eggerthii单独即在早期诊断中具有特殊价值。结论提示，双重组学数据揭示了CKD的肠道微生物和被干扰的循环代谢物之间的联系，这可能具有重要的病因学和诊断意义。
论文ID
原名：Integrativemetagenomic and metabolomic analyses reveal severity-specific signatures of gutmicrobiota in chronic kidney disease
译名：整合宏基因组和代谢组学分析揭示了不同严重程度的慢性肾脏疾病中肠道微生物特征
期刊：Theranostics
影响因子：8.063
发表日期：2020.04.06
通讯作者：台湾长庚大学
作者单位：Shih-ChiSu
实验设计
实验结果
慢性肾脏疾病(CKD)通常与代谢和心血管并发症相关，对社会造成严重的医疗负担。许多危险因素，包括年龄、性别、遗传、接触重金属、吸烟、过度饮酒、病毒感染、肥胖、高血压和糖尿病，已被证明是相互关联的，并且对于评估CKD预后和影响其发展为终末期肾病(ESRD)是必要的。如此复杂的病因增加了疾病的临床异质性，识别可操作的CKD易感因素以阻止疾病进展到终末期肾病(ESRD)，刻不容缓。
证据表明CKD和ESRD的发生发展与肠道微生物的组成和功能有关。虽然暂时没有定论，但与正常对照组相比，ESRD患者的肠道菌群结构改变，Firmicutes（厚壁菌）, Actinobacteria（放线菌）和Proteobacteria（变形杆菌）显著富集，双歧杆菌和乳杆菌丰度减少。值得注意的是，菌群对肠道环境变化的不适应可以在疾病早期阶段被检测到。这种肠道生物失调，加上肠道屏障功能受损，通过调节细菌移位以及循环中存在内毒素和其他有毒产物，决定了CKD的整体炎症状态。除了调节宿主免疫外，肠道细菌还通过产生饮食衍生的生物活性代谢物来发挥内分泌器官的作用，这些代谢物可能具有肾毒性或肾脏保护潜力。尤其是，尿毒症毒素或尿毒症毒素前体，如三甲胺N-氧化物(TMAO)、硫酸对甲酚(PC)和硫酸吲哚酚(IS)，是肠道微生物营养加工的结果，可能导致肾脏和心血管损害。此外，与CKD患者或动物的各种致病过程有关的微生物营养转化还包括氢氧化铵、短链脂肪酸(SCFAs)和次级胆汁酸。综上所述，整合宏基因组和代谢组学分析可能有助于通过肠道生态系统中的相关变化更好地理解CKD的发展。
尽管基于16S rRNA的测序在医学微生物学方面取得了重大进展，但与16S rRNA基因测序相比，深度鸟枪法宏基因组测序对人类微生物群的分类学特征及功能提供了更深入了解。到目前为止，肠道微生物群对慢性肾脏病的研究主要集中在疾病的晚期或早期肾功能下降。在这里，我们利用一种综合的方法，通过对粪便样本进行鸟枪法宏基因组测序，并有针对性地对不同严重程度的CKD患者和非CKD对照者的血清胆汁酸、SCFA(<6个碳原子)、中链脂肪酸(MCFA，6-12个碳原子)和尿毒症毒素(PC和IS)进行分析，将肠道菌群信息与循环宿主-微生物共代谢物联系起来。我们的双重组学分析揭示了几个与循环代谢物和疾病严重程度密切相关的非生物基因/途径和物种水平分支，这可能具有病因学和诊断意义。
为了探索CKD中肠道微生物与宿主循环代谢物的关系，我们从92名纳入者的横断面队列中收集粪便DNA和血清样本，包括72例(26例CKD1-2期，26例CKD3期和20例CKD4-5期)和20例非CKD正常对照，进行鸟枪法宏基因组测序和靶向代谢组学分析。由于特定的肠道生物失调与CKD最常见的两种合并症（糖尿病和高血压）相关，我们纳入了肾功能正常、年龄、性别和糖尿病和高血压状况相匹配的非CKD对照者(表1)，以排除潜在的混杂因素。血清尿素氮、血肌酐和eGFR反映了各组之间的疾病严重程度。
表1：纳入人群的基线特点。
为了全面探索与CKD进展相关的肠道微生物群，进行鸟枪法宏基因组测序，执行质量控制检查、过滤和宏基因组组装。我们首先比较了不同组别的肠道微生物多样性。随着疾病的严重程度，样本内物种丰富度(α多样性)呈下降趋势，因为晚期CKD组的物种丰富度显著低于非CKD对照组(图1A)。相反，我们在CKD微生物群中观察到更高的样本间差异(β多样性)(图1B)，表明不同CKD组之间的肠道菌群结构比对照组更不均匀。为更详细地分析分类学特征，我们将每个CKD严重程度组与非CKD对照组进行了比较，并根据213个物种水平的丰度进行了LEfSe分析。总体而言，在至少一个CKD组(图1C)中，分别有7种物种显著减少和6种物种显著增多 (p<0.01)。我们注意到两种显著的物种水平变化模式：一种在早期到晚期阶段改变(升高或减少)，而另一种仅在特定阶段改变。前者的特征是丰度减少的4个物种(Prevotella sp.885, Weissella confuse, Roseburiafaecis, 和 Bacteroideseggerthi)和丰度增加的3个物种(Alloscardoviaomnicolens, Merdibactermassiliensis, 和 Clostridiumglycyrrhizinilyticum)。后者的特征是Cetobacteriumsomerae(轻度CKD)、CandidatusStoquefichus sp. KLE1796(轻度CKD)、Fusobacteriummortiferum (中度CKD)、Bariatricusmassiliensis (中度CKD)、Bacteroidesstercorirosoris (中度CKD)和Merdimonasfaecis(重度CKD)。进一步分析表明，Prevotella sp.885 丰度的下降与我们队列的尿中尿素排泄相关(图1D)，暗示肠-肾轴在肾损害中的作用。
为了检测CKD严重程度的变化，我们对11种饱和脂肪酸、26种胆汁酸和2种尿毒症毒素(IS和PC)进行了有针对性的代谢谱分析。与非CKD对照组相比，至少有一个CKD组的4种脂肪酸(癸酸、己酸、丙酸和庚酸)显著降低(p<0.01)，晚期CKD的两种肾毒素(IS和PC)显著升高(图2A)。己酸和PC水平分别与肾小球滤过率呈正相关和负相关(图2B)。此外，在慢性肾脏病的晚期，注意到两种胆汁酸(甘氨酸脱氧胆酸和甘鹅脱氧胆酸)和三种脂肪酸(戊酸、乙酸和辛酸)的轻度下降但具有显著性意义。
在CKD进展过程中，微生物与代谢物之间的机械关系受到干扰，为了研究特定的肠道微生物是否参与其中，我们对213个物种与循环代谢产物的关联进行了评估。我们确定了一组与PC水平呈正相关的物种(图3)，其中许多物种在FEfSe或随机效应模型分析中被鉴定为生物标记物，表明这种关联可能参与了CKD的发病机制。
虽然不具有统计学意义，但总的来说这些PC相关肠道微生物的丰度与检测到的许多次级胆汁酸水平呈正相关，而与许多初级胆汁酸、SCFA和MCFA的水平呈负相关，暗示这些脂肪酸和胆汁酸与肾功能有关。值得注意的是，Alistipes obesi和Gordonibacter pamelaeae与PC水平呈正相关，而与显著降低的MCFA、癸酸水平呈负相关。这些结果揭示了CKD进展中的宿主-微生物-代谢物网络。
我们接下来研究了不同严重程度的CKD组间肠道微生物组的功能。通过将我们的细菌基因目录映射到KEGG数据库，我们获得了7513个KEGG同源基因(KO)，存在于至少五个样本中，用于后续分析。我们将重点放在与饮食代谢相关的5条途径上，与非CKD对照相比，总共确定了25个差异富集的KEGG模块(图4A)，其中大多数是在晚期检测到的(12个病例富集和10个对照富集)。在CKD微生物群中，与类固醇生物合成、醚类脂肪代谢和多不饱和脂肪酸代谢等脂质代谢相关的基因在CKD组微生物群中富集，而与碳水化合物和氨基酸代谢相关的基因在对照组中更为富集。值得注意的是，参与脂多糖(LPS)生物合成的基因在晚期病例中富集，提示炎症反应的升高可能促进CKD发展。此外，与次级胆汁酸生物合成相关的基因在早期阶段差异富集，表明肠道微生物将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸在早期肾功能下降过程中发生。
因关注诱导宿主炎症和肾毒性代谢物，我们检测了微生物基因丰度，以验证微生物在选定的生物失调模块中的作用，如LPS生物合成、次级胆汁酸生物合成和酪氨酸代谢(图4B)。我们注意到，负责LPS核心低聚糖生物合成的基因丰度在CKD进展过程中发生了变化(图4C)。具体地说，在CKD终末期，编码修饰核心骨架的酶(WaaP，WaaQ)的基因丰富，而编码构成核心骨架的糖基转移酶(WaaC，WaaF)的基因减少，这表明在CKD的生理病理中LPS的稳定性和结构发生了变化。此外，我们还观察到CKD微生物群中与初级(鹅去氧胆酸)转化为次级胆汁酸相关的基因丰度升高。值得注意的是，升高的基因(K00076，hdhA)的丰度与中间代谢产物熊去氧胆酸的血清水平显著相关，突出了肠道微生物群在CKD患者血清胆汁酸升高中的作用。对于酪氨酸代谢(晚期病例的富集模块)，我们发现晚期基因丰度的变化(tyrB的富集和tpl的缺失)有利于对甲酚的前体4-羟基苯基丙酮酸的产生。这在一定程度上解释了在肾病终末期观察到的血清PC水平升高(图2A)。
对造成这些生物失调模块的主要物种进一步分析(图4D)显示，LPS生物合成的增强部分归因于大肠杆菌和肠杆菌科其他物种丰度的增加。其中一个显著减少的物种蛋类杆菌Bacteroides eggerthii在一定程度上促进了次生胆汁酸的早期合成。这些发现指出肠道生物失调及其相关的功能转变参与调节炎症反应和代谢活动。
为了检测肠道代谢组和血清代谢组学参数作为诊断标志物的潜力，我们构建了仅基于物种、仅基于代谢物(排除两种高度鉴别的尿毒症毒素，IS和PC)的随机森林回归模型，或两者的组合(图5A)，以区分具有不同严重程度的CKD和非CKD对照。三种模型之间分类潜力的比较显示，组合模型在区分三个CKD严重程度组与对照组方面优于物种或代谢物纯模型，表明通过使用双重组学，区分能力有所提高。联合模型检测晚期CKD和轻度CKD的ROC曲线下总面积(AUC)分别为0.95和0.90。与以MCFAs(己酸居首，癸酸次之)为特征的中度CKD分类不同，早期和晚期CKD分类的高度区分性标志物是细菌种(Bacteroides eggerthii和Prevotella sp. 885 分别是早期和晚期的特征菌属)。此外，通过单独评估那些差异丰富的物种(图1)和代谢物(图2)，确定了几个对特定CKD严重组具有临床有效性的个体标记物(表2)。其中，与尿蛋白/肌酐比(AUC，0.64)或血尿素(AUC，0.72)相比，Bacteroides eggerthii 对诊断早期CKD的AUC(0.80；95%CI，0.67-0.93)更高。我们的结果揭示了有望通过特定肠道微生物早期诊断慢性肾脏病。
讨论
肠道菌群失调及其相关的宿主代谢和炎症改变可能决定了CKD的发生发展。然而，最近关于CKD的人体肠道微生物群的研究一直是基于16SrRNA，主要集中在疾病的晚期。因此，对CKD微生物群进行深入的分类和功能鉴定是非常有必要的。在这里，我们在物种水平上确定了特定的肠道生物失调及其相关的功能转变与不同阶段CKD的循环代谢物有很强的相关性。这些联系突出了肾功能障碍进展过程中潜在的宿主-微生物-代谢物相互作用。
在肠道微生物区的组成变化中，在种水平上观察到了两种显著的变化模式。一种是从早期到晚期的富集或减少，而另一种只在特定的阶段发生了变化。在这些差异丰富的微生物中，Bacteroides eggerthii 和Prevotella sp. 885分别是轻度和重度CKD分类的最高鉴别特征菌种(图5A)。除了Prevotella sp. 885，还有两个降低的菌种(Weissellaconfuse和Roseburia faecis)和两个升高的菌种(Merdibactermassiliensis和Clostridiumglycyrrhizinilyticum)与CKD从早期发展至晚期高度相关，并能够区分非CKD对照组和晚期CKD患者。值得注意的是，除Bacteroides eggerthii外，另有两个菌种，即Cetobacterium somerae (在轻度CKD者中升高)和CandidatusStoquefichus sp. KLE1796在(轻度CKD者中降低)是区分非CKD者和轻度CKD患者的最具鉴别意义物种。由于CKD早期无症状特征，肾功能障碍可能在几年后变得不可逆转，如果不及早诊断，最终可能进展为终末期肾病(ESRD)。我们证明，除了使用一组选定的分类学和代谢标记外，Bacteroides eggerthii 单独在区分对照和早期CKD方面表现出色。此外，Prevotellasp. 885反映了CKD的病程进展，并与尿素排泄呈正相关，反映了蛋白摄取和肾功能。这些结果表明，特定的肠道微生物可作为CKD早期诊断和预后监测的有用生物标志物。
在确定CKD的循环代谢特征时，观察到尿毒症毒素(IS和PC)的升高和SCFA(丙酸、戊酸和乙酸)的减少，这与其他研究是一致的。在这些SCFA中，丙酸在晚期显著降低，并且在非CKD对照组和晚期CKD患者之间具有高度的区分性(图5A)。值得注意的是，我们确定了一些MCFA(癸酸、己酸和辛酸)在非CKD对照组中富集。MCFA已被证明具有抗细菌和病毒的特性，并且在炎症性肠病(IBD)患者的粪便样本中显著减少。在这里，己酸水平(除IS和PC外)被预测为中晚期CKD的头号鉴别代谢物，与eGFR高度相关，表明其对肠道炎症的有利作用以及对肾功能障碍的潜在诊断价值。我们还观察到血清胆汁酸水平的波动，尽管这些变化没有达到统计学意义。胆汁酸通过核法尼醇X受体和G蛋白偶联受体5调节宿主体内的众多代谢途径，在终末期肾病患者的血清中差异丰富。我们的结果与其他人的结果，为通过这些宿主-微生物共代谢产物改善CKD的诊断提供了潜在的途径。
此外，我们还鉴定了与宿主血清代谢物改变有关的肠道微生物种类。有趣的是，基于每种微生物和代谢物之间的联系，MCFA和SCFA可以分为两个不同的簇，以及二级胆汁酸和初级胆汁酸可以分开(图3)。这些微生物-代谢物组合很可能与在CKD发展过程中受到干扰的菌群丰度-代谢物之间的机械关系一致，可能表明该物种产生了该代谢物，或者该代谢物促进/抑制了该物种的生长。例如，Clostridiumglycyrrhizinilyticum (属于梭菌属第XIVa簇的一个显著升高的物种)与次级胆汁酸-甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)之间存在正相关。在人类中，已知XIVa梭菌能产生次级胆汁酸，口服GUDCA可促进结肠炎小鼠XIVa梭菌的生长。此外，Bacteroidesintestinalis，一种由随机森林分析预测的高度区分性物种，与血清脱氧胆酸(DCA)水平呈正相关。生化测试表明，Bacteroides intestinalis能将胆酸转化为其7-氧代衍生物（7-氧代-DCA）。另一个相关的例子是检测到Alistipes shahii (一种吲哚阳性物种)和IS之间的联系。这些相互联系反映了肠道生态系统内的机械性联系，它们共同可能成为CKD发病的决定因素。
肠道微生物群在CKD中的功能能力在很大程度上还没有被探索。在这里，我们重点研究了与微生物转化相关的途径，发现与脂质代谢相关的途径模块（如类固醇生物合成、醚类脂肪代谢和多不饱和脂肪酸代谢）在晚期CKD中的微生物群富集。代谢综合征，通常与血脂异常有关，仍然是CKD的关键病因学参数。在不同的脂质类型中，富含在细胞膜脂筏微域中的乙醚类脂在膜动力学和细胞信号传递中起着至关重要的作用。血清醚脂水平的降低与高血压、肥胖症和糖尿病有关。不管潜在的机制如何，我们的发现首次表明，肠道微生物对乙醚类脂的分解可以作为诊断CKD或其他合并症的标志。除脂质代谢模块外，与LPS生物合成相关的微生物基因在晚期CKD中更为丰富。这一发现与血清LPS水平随肾损害程度增加而升高的观察结果一致，并在CKD晚期达到高峰。LPS结构的一个关键特征是在内核主干的七糖残基上存在磷酰基(图4C)。LPS的这种修饰对于细菌外膜的稳定性及其完全毒力至关重要，可能是因为负电荷允许邻近的LPS分子通过二价阳离子交联。值得注意的是，编码修饰核心主干的酶(WaaP，WaaQ)的基因在晚期CKD微生物群中富集，表明通过增强细菌外膜完整性，炎症反应持续升高。通过对CKD微生物群中优势种的分析，我们发现LPS生物合成的增强部分归因于大肠杆菌和肠杆菌科的其他物种以及变形杆菌门的增加，这在一定程度上是由于大肠杆菌和肠杆菌科的其他物种以及变形杆菌门的增加造成了LPS生物合成的增加。这些物种生成特定的酶，促进产生含六酰化脂质A部分的LPS，因为六酰化LPS(6酰基)与TLR4结合时的免疫刺激作用是五酰化LPS(5酰基)的100倍。这些结果提示了内毒素的产生对CKD具有免疫刺激作用。此外，另一个有趣的发现是黄曲霉毒素生物合成模块在CKD微生物群中的富集。黄曲霉毒素的肾毒性效应已经在人类和实验啮齿动物模型中观察到。我们的宏基因组分析一致支持这种肠道菌群衍生的次生代谢物在CKD病因学中的作用。综上所述，我们在这项研究中的发现概括了肠道生物失调在CKD发展过程中参与炎症和代谢反应。
为了确定肠道微生物组的功能及其与CKD宿主的关系，需要额外的工作来解决本研究的几个局限性。一个缺点是缺乏重复队列，尽管我们的宏基因组和代谢组学结果与其他人之前的发现是一致的。关于纤维摄入量的信息也是不可获得的，因为膳食纤维的摄入可能会改变肠道微生物生态。另一个问题是，由于到目前为止相关研究的知识有限，许多已识别的联系仍有待解释和确认细节。理想情况下，验证这些微生物-代谢物的相互作用及其在CKD发病机制中的作用可以通过进一步的活体实验来解决。这样的尝试通常需要大费周折；因此，通过整合双组学对研究中检测到的假定联系进行计算探索可能是一个重要的帮助。
综上所述，我们的发现在物种水平上建立了对CKD不同阶段肠道微生物与宿主代谢之间关系的全面理解，为基于微生物组的肾脏损害的诊断提供了潜在的途径。
评论
既往关于CKD与肠道微生物群的研究多是基于16SrRNA，研究对象多为终末期肾病。本文中，通过宏基因组学和代谢学的双组学分析在物种水平上确定了特定的肠道生物失调及其相关的功能转变与不同阶段CKD的循环代谢物有很强的相关性。这些联系突出了肾功能障碍进展过程中潜在的宿主-微生物-代谢物相互作用，这可能具有重要的病因学和诊断意义。
原文网址：https://www.thno.org/v10p5398