【催化】Nat. Chem.：利用从头设计的蛋白骨架实现路易斯酸催化的Diels-Alder反应
Diels-Alder（DA）反应在天然产物的合成当中具有非常广泛的应用，利用该反应可以实现两个新的σ 键以及最多四个连续手性中心的构建。尽管在实验室中利用金属离子的路易斯酸催化是很常用的策略，自然界中能够催化该反应的酶却极其少，并且最近才发现的这些酶主要是在聚酮类分子的生物合成中促进分子内的环加成反应。利用人工设计的酶或者具有催化活性的抗体也能够催化该反应，但催化效率普遍比较一般。近日，苏黎世联邦理工学院的Donald Hilvert联合加州大学洛杉矶分校的Gonzalo Jiménez-Osés报道了他们利用计算设计的蛋白DA7高效、高立体选择性地催化杂-Diels-Alder反应。相关成果发表在Nat. Chem.上（DOI: 10.1038/s41557-020-00628-4）。
首先，作者选取氮杂查尔酮1和3-乙烯基吲哚2作为底物（图1），实验发现，在三氟甲磺酸锌的DMSO溶液中，DA反应产物3和氧杂DA产物4的比例是1:3，而在硫酸锌的水溶液中的产物比例是1:19。并且在产物4中，endo型和exo型的比例在DMSO和水溶液中分别是4.6:1和18:1。由此可见，开发一种高效、高选择性的生物催化剂，以促进众多反应路径中的一条而得到单一的产物，这在化学上是很有意思的挑战。
图1. 底物1和2的竞争DA和杂-DA反应
（图片来源：Nat. Chem.）
接下来，作者以先前报道的通过计算设计产生的能够催化酯化反应的蛋白MID1sc为起始进行研究，实验发现该起始蛋白并没有催化1和2发生任何反应的能力。于是，作者利用基于DFT的Rosetta设计预测了两个突变体E32L和K68W可能具有增强底物结合和稳定过渡态的作用，这两个位点本身是位于结合口袋两端结合了锌离子的残基。引入了这两个突变的蛋白称作DA0，实验发现DA0具有较低的催化活性。为了进一步提高催化活性，作者开始了针对DA0的改造。首先作者选取了8个可能的底物结合位点的残基进行突变，利用光谱分析监测底物2的消耗，从中筛选出五个位点的残基再次进行重组随机突变。对该重组库的筛选得到了DA1，该蛋白相对于DA0多了H35C和I64G两个突变位点。该双突的蛋白又经过两轮连续的易错PCR、热点残基的聚集诱变以及有利突变的混合叠加，得到了高活性的突变体蛋白DA7（图2a）。DA7包含12个突变，均匀地分布在蛋白骨架的螺旋-转角-螺旋部分的N端到C端（图2b），其中包含靠近金属结合位点没有配位作用的35位组氨酸被半胱氨酸取代，以及之前与金属配位的39位组氨酸被丙氨酸取代。这些突变都表明了锌离子配位环境的改变。除了这些突变位点之外，只有早先通过计算设计引入的32位亮氨酸和68位色氨酸以及第一轮突变中发现的64位甘氨酸是位于推测的结合口袋的，其他突变的位点则都是远离结合口袋的。作者推测DA7可能是通过具有稳定蛋白或者微调活性位点的空间结构来提高催化活性的。之后作者研究了DA7的催化性能，结果显示其比目前发现的催化该类反应的天然酶更加高效。除此之外，DA7催化该反应可以产生endo型杂DA产物，立体选择性高达99%，并且可以实现制备规模的转化得到光学纯的产物。
图2. a. DA0和DA7分别催化底物1跟2的反应；b. 基于MID1sc的突变模型（黄色：锌离子；橙色和红色：突变位点；灰色和蓝色：配位的组氨酸）
（图片来源：Nat. Chem.）
为了更好地理解DA7高催化活性的原因，作者对DA7蛋白进行结晶实验，并解析了该蛋白的晶体结构（图3a），分辨率达到1.5 Å。从晶体结构可以看出，跟作者预测的一样，H35C和H39V两个突变改变了金属的配位环境，并且引起了空间构型的改变，使得螺旋-转角-螺旋的交叉角度减小了超过30°,这种结构的改变为两种底物创造了更加封闭的疏水环境。由于未能得到底物与酶的复合物的晶体结构，作者进行了分子对接和动力学模拟实验来进一步揭示催化的机理。从对接的结果分析（图3b），作者指出首先螺旋-转角-螺旋的N端与底物1通过范德华力相互作用，并且底物1的羧基与28位精氨酸的胍基之间形成盐桥，从而固定底物在空腔的位置。底物2结合在C端，吲哚环置于I64G突变产生的小疏水口袋里面，乙烯基部分对着底物1的si面。其次，两性离子中间体以及过渡态还被吲哚的NH与 80位谷酰胺的酰胺侧链之间的氢键作用所稳定。后续作者也通过进行突变以及更换底物的实验验证了以上的分析。
图3. a. DA7的晶体结构；b. 反应过渡态的对接模型；c. 活性位点的剖视图；d. 将b翻转90°的视图
（图片来源：Nat. Chem.）
总的来说，作者从计算设计产生的具有97个氨基酸的MID1sc蛋白出发，利用设计和定向进化的方式得到具有高效、高选择性催化杂-DA反应的蛋白DA7。这种策略为设计和发展各种具有非自然功能的生物催化剂提供了新的途径。