在本文中，研究者通过对1010个肿瘤样本和516个附近正常组织样本进行了分析对比。结果发现，从头部到骨骼，每一种肿瘤的样本中的细菌DNA水平都显著高于正常组织和石蜡切片对照组，而且其中细菌的组成也各不相同。该研究团队共验证了7种肿瘤，分别是乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌和脑癌组中的微生物组成。同时，研究者还发现在所有发现有微生物存在的肿瘤中，乳腺癌的微生物是多样性最高的，平均每个乳腺肿瘤样本中有16.4种细菌，而其他肿瘤平均只有9种。除此之外，研究人员还发现，肿瘤中的细菌的种类和丰度的差异可能还与肿瘤本身的特征和治疗效果有关。
1.多种人类实体肿瘤中检测到细菌DNA、RNA和LPS的存在
由于肿瘤内部微生物的生物量相对较低，部分研究者认为这可能是样本受到污染的结果。因此，在研究肿瘤内部微生物的过程中，采取多种措施来避免或准确检测到任何可能的污染从而排除干扰是至关重要的。对于下一代测序样本准备，在DNA分离过程中使用机械组织剪切以确保从革兰氏阳性细菌的细胞壁中完全回收DNA是十分重要的，而这一步骤在大多数标准的DNA分离方案中都没有包含。在本研究中，为了较好的表征肿瘤内的细菌，研究者对肿瘤病人的实体肿瘤样本采用了多种组合方法来检测细菌的DNA/RNA、细菌外膜或细胞壁成分。该研究团队重点研究了七种实体肿瘤，这些肿瘤样本既可以代表临床上最为常见的肿瘤类型，也可以代表肿瘤内微生物基本未知的肿瘤类型，如黑色素瘤、骨肿瘤和脑部肿瘤(图1A)。同时，为了减小实验室污染物的传播对样本的干扰，该研究纳入了643个处理样本的阴性对照，包括437个DNA提取对照和206个PCR无模板对照(no-templatecontrols, NTCs)。此外，为了解决样本到达实验室之前可能发生的污染，研究还收集了168个从研究中使用的石蜡切块(没有组织)边缘提取的纯石蜡样本(图1A)作为对照。该研究总共分析了1010个肿瘤样本和516个正常样本，包括来自相同患者的正常邻近组织(normal adjacenttissues, NAT)(图1A)。在卵巢癌的样本中，研究所收集的正常样本来自患者的卵巢或子宫，或来自不匹配的健康受试者的正常输卵管菌毛。为了定量细菌的DNA，该研究使用针对细菌16S rDNA的通用引物967F和1064R进行实时定量PCR分析。结果发现，所有肿瘤组织中的细菌DNA水平均显著高于DNA抽提组和石蜡对照组(图1B)。此外，该研究还发现不同的肿瘤类型中细菌DNA的比例也不尽相同，从黑色素瘤的14.3%到乳腺、胰腺癌和骨肿瘤的超过60%不等。同时，在与外部环境没有直接联系的实体肿瘤组织中也检测到细菌的DNA，如卵巢癌、多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)和骨癌。为了验证人体肿瘤组织中细菌的存在，该研究对另外400个肿瘤样本(与上述1526个样本无关)进行了细菌染色，这些肿瘤代表了上述七种肿瘤类型中的六种。研究使用抗细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和脂磷壁酸(lipoteichoicacid, LTA)的抗体进行免疫组织化学来检测革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。此外，研究还使用RNA荧光原位杂交技术(FISH，一种针对细菌16S rRNA的通用探针)来检测肿瘤组织中的细菌RNA。为了控制非特异性染色，还对样本进行了IHC阴性对照(无一抗)和FISH阴性对照(非特异性补体探针)。研究发现，在所有肿瘤类型中都可以检测到细菌的LPS和16S rRNA (图1C)，并显示出相似的空间分布(图1D)，而 LTA则主要在黑色素瘤中检测到，其他类型的肿瘤中则大部分缺失。通常情况下，使用可视化方法比使用qPCR的方法能发现更多的肿瘤内部的阳性细菌，这种差异可能是因为目前的qPCR检测技术的灵敏度有一定的限制，也可能是因为对确认样本为阳性的严格阈值造成的。
图1人类肿瘤组织中检测到细菌成分. (A)研究中分析的人体肿瘤样本数目。正常样本包括正常组织样本和肿瘤样本的邻近正常组织(normal adjacent tissue, NAT); GBM: 多形胶质母细胞瘤.(B) 细菌16S rDNA qPCR检测肿瘤组织中细菌DNA的存在。通过将细菌DNA添加到宿主DNA中得出的校准曲线来估计细菌的负荷，然后将其与批次特异的对照进行归一化. (C) 16S rRNA、LPS或LTA染色阳性肿瘤比例的热图. (D) H&E、LPS抗体或针对细菌16S rRNA的FISH探针对4种人源肿瘤组织的染色切片，字母(T)表示源自肿瘤的样本。
2.瘤内细菌主要存在肿瘤细胞和免疫细胞中
肿瘤细胞核的病理检查结果表明，LPS和细菌16S rRNA主要定位于肿瘤细胞和免疫细胞(图2A)。在肿瘤细胞中，细菌16SrRNA主要在胞质中检测到，而LPS染色在胞质和胞核中均可检测到(图2B)。16S rRNA染色显示CD45阳性的免疫细胞通常比肿瘤细胞具有更强的细胞质细菌染色(图2C)。通过H&E染色检测到LTA阳性的细菌几乎只存在于巨噬细胞中，并通过CD68的免疫荧光染色得到证实(图2D)，而在肿瘤细胞和CD45+/CD68−的免疫细胞中很少检测到LTA(图2)。虽然细菌LPS和LTA染色在CD45+/CD68+细胞中阳性较高，但通过荧光原位杂交技术只在巨噬细胞中发现很少的细菌16S rRNA(图2A和D)。S4和S6)，上述差异可能反映了巨噬细胞只是摄取了细菌成分，而并非是活细菌，也可能是由于细菌被巨噬细胞长时间吞噬和加工后，LPS和LTA在巨噬细胞中的积累所致。已经有研究证明，巨噬细胞对细菌LPS的处理非常缓慢。因此，这些细胞中，LPS可以在细菌被吸收和处理几个月后仍被发现。为了进一步证实肿瘤细胞内细菌的存在，研究者对4个细菌LPS和16S rRNA阳性的乳腺癌样本进行了光学-电子显微镜分析，同时结合LPS荧光染色和透射电子显微镜观察细菌在4个肿瘤组织中的胞内定位(图2E)。在多数情况下，细菌都存在于核膜附近。由于研究者在透射电镜未检测到核内细菌，因此怀疑LPS在胞内定位为胞浆内的核周细菌染色。细菌16S rRNA 的FISH染色在细胞内呈弥散信号，而典型的棒状菌或球菌很少被检测到(426个核中仅有3个)。此外，在肿瘤细胞中也没有检测到细胞壁聚合物LTA的成分，尽管通过16S rRNA测序在人类肿瘤组织中检测到了许多革兰氏阳性细菌。该结果表明肿瘤细胞中的细菌可能已经改变了它们的包膜，导致了类似L型的细胞壁缺陷状态，而缺乏细胞壁的细菌只存在于细胞内，并且在细胞内其形态转变为大小和形状高度变化的不明确结构，而该研究的透射电镜图像也表明许多细胞内的细菌缺乏细胞壁。
图2 肿瘤内细菌存在于癌细胞和免疫细胞内. (A) LPS、LTA和细菌16S rRNA在459、427和354个肿瘤细胞核的染色，其中巨噬细胞(CD45+/CD68+)，CD45+/CD68−标记为其他类型的免疫细胞. (B-D)图中显示了人类肿瘤组织中代表性的染色标记, 其中星号标记为放大倍数更高的区域. (B)乳腺癌细胞中存在细菌LPS和16S rRNA. (3)高度炎性浸润的乳腺肿瘤中CD45+/CD68−细胞呈LPS和16SrRNA阳性. (D)典型巨噬细胞相关细菌(M)染色的黑色素瘤，其中LPS和LTA染色阳性，16S rRNA染色阴性; 邻近肿瘤细胞(T)呈典型的LPS和16S rRNA染色，LTA染色阴性. (E) 光-电连用显微镜显示乳腺癌细胞内细菌, DAPI为蓝色, LPS为红色; 两种细菌用箭头标出, 同一细胞的TEM图像以灰度显示.
3. 乳腺肿瘤内的微生物与其他类型的肿瘤相比其丰富度和多样性更高为了进一步的表征肿瘤内的微生物，该研究团队开发了一种多重16S rDNA测序方法，沿着16S rRNA基因依次扩增5个短区，即5R 16S rDNA测序法(图3A)。该方法与之前被广泛使用的V4或V3-V4扩增方法相比，通过使用短扩增法来扩增68%的细菌16S rRNA基因，显著提高了细菌种类检测的覆盖率和分辨率。此外，该方法还可以应用于福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织中部分降解的DNA。研究分别从1526个样本和811个阴性对照(DNA提取对照、16S 5R PCR对照和石蜡包埋对照)的读数以Short MUltiple Regions Framework和Greengenes数据库为参考，通过计算组合成长扩增片段。此外，为了改善分类学分配算法，研究者使用核糖体数据库(Ribosomal Database Project, RDP)分类器来扩充Greengenes数据库，通过将物种分类法分配给380,000个最初缺乏这种分类法的细菌16S rRNA序列。其中，在所有收集的样本中，有39个样本和10个对照的归一化读数低于1000的样本被丢弃，这些数据将不再进行进一步的分析。总体而言，该研究团队在不同的肿瘤组织或正常组织中共计检测到9190种细菌(图3B)。此外，由于这些物种中的一些可能来源于样品的污染，研究者分别使用了6个严格的过滤器来控制样本中潜在的污染源。为了解决最常见的污染物，过滤器1去除了在超过7.5%的DNA提取和NTC阴性对照样品或石蜡对照样品中检测到的167种细菌，此阈值区分了大多数在控件条件中不存在或很少出现的物种与在控件条件中更常见的物种。然后，研究者使用过滤器2到4来控制来源于DNA提取、PCR扩增或测序通道的批次效应，并使用数百个阴性对照作为实验室污染的背景值。此外又添加了过滤器5和6，以控制在实验室处理样品之前可能引入到样品中的污染，其中过滤器5使用来自研究中的相同石蜡块边缘的空白石蜡样本(没有组织)，以控制在制备和储存石蜡块的过程中的污染。最后，为了说明医疗中心特定污染源的其他潜在来源，研究者筛选了6个跨多个医疗中心的特定肿瘤组织中未显著富集的细菌，只有通过了所有六个过滤器的细菌种类才被认定是出现在该肿瘤组织或NAT样本中。该研究发现乳腺癌组织中的微生物与所有其他检测的肿瘤类型相比，其丰富度和多样性都更高(图3C-D)。在任何一个乳腺癌组织样本中，平均可以检测到16.4种细菌，而在其他所有类型的肿瘤样本中，平均检测到低于9种细菌。此外，研究还发现，乳腺癌组织样本中的细菌载量和丰度均显著高于健康受试者的正常乳腺组织样本。癌旁的正常乳腺组织的细菌载量和丰度介于肿瘤组织和正常样本之间(图3F)。相反，该研究没有发现肺和卵巢肿瘤与其邻近的正常组织相比有更高的细菌载量。接下来，为了确定肿瘤组织中是否存在活的细菌，研究者从五名接受乳房手术的女性患者体内采集了新鲜的肿瘤组织样本。所有组织都在无菌条件下分离，接种于35种琼脂培养基，其中包含常氧和厌氧条件，上述不同条件可以一定程度上代表细菌的生长环境以适应细菌的高度多样性。与LPS和16SrRNA FISH阳性染色结果一致的是，4个肿瘤组织中每个肿瘤生长超过1000个菌落，1个肿瘤组织生长37个菌落。相比之下，使用相同步骤的组织分离和培养方案对5组阴性对照板使用PBS接种，总共只产生5个菌落。来自所有5个肿瘤组织的474个代表性菌落的全基因组测序分析表明，其总共代表37个不同的细菌种类，其中11个(29.7%)属于之前在该研究团队的乳腺肿瘤队列中检测到的细菌，此外还有15个分离物种(40.5%)在该队列中被分离，但是最终没有通过所有的筛选。对于105个菌落，研究者未能在种水平上进行鉴定。总体而言，上述结果表明，在乳腺肿瘤组织中可以检测到来自三个主要门类的活细菌，分别是Proteobacteria、Firmicutes以及Actinobacteria。为了进一步验证所收集的肿瘤组织中是否存在具有代谢活性的活细菌，研究者在荧光标记的DMSO对照条件下，体外培养了4个新鲜切除的乳腺肿瘤组织。虽然D-丙氨酸被细菌用来生成细胞壁的基本成分肽聚糖，但哺乳动物细胞并不适用。研究者在所有4种肿瘤组织中都检测到了细胞内标记信号，该结果支持了研究者对肿瘤细胞中含有活的细菌的假设(图3G)。
图3 乳腺肿瘤组织内的具有更高丰度和多样性的微生物. (A)细菌16S rRNA基因及其保守(蓝色)和可变(黄色)区域的图形表示。以Escherichia coli K-12 菌株 MG1655的序列作为参考序列. (B)16S rDNA测序数据的分析示意图. (C)稀释曲线显示通过不同肿瘤类型的所有过滤器的细菌属的数量. (D)所有样本按肿瘤类型分类的Shannon多样性指数的箱式图. (E) 箱式图显示每个肿瘤中存在的细菌种类数量. 对于(D)和(E)，根据每种肿瘤类型中40个样本的稀有数据计算数值，迭代10次。对于每一次迭代，只有通过任何肿瘤类型的所有过滤器的细菌才被包括在分析中. (F)乳腺肿瘤、癌旁组织和乳腺正常组织样本中通过所有过滤器的细菌属数的稀释曲线. (G)用荧光标记的D-丙氨酸体外培养2小时的4例乳腺肿瘤的荧光图像.
4 不同的肿瘤类型有不同的微生物组成
使用单一测序方法和平台表征多种肿瘤组织的微生物，能够更加直接地比较这些肿瘤组织中的微生物组成。通过比较不同肿瘤类型内部和不同肿瘤类型之间的所有样本对的beta多样性，研究者发现同类型肿瘤的微生物群落比其他肿瘤类型的微生物群落相似更高(图4A)，在目水平上的物种差异分析显示了不同肿瘤类型的细菌组成之间具有明显的变化(图4B)。研究者还将来自一个医学中心的22个结直肠肿瘤样本添加到其所纳入的队列中，以便于将该研究的上述结果与已知的结直肠癌微生物测序数据关联起来。与之前的报导一致，厚壁菌门和拟杆菌门的细菌在大肠癌中最为丰富(图4B)。相比之下，与正常的十二指肠微生物组成相似，变形菌门在胰腺癌的微生物中占主导地位，正如该研究团队之前报道的，这可能反映了从十二指肠到胰管开口细菌的逆行迁移。虽然属于变形菌门和厚壁菌门的物种占所有肿瘤类型中检测到的细菌序列的大部分，但其丰度的比值(P/F)似乎在不同的肿瘤类型之间有所不同(图4B)。该研究还检测了放线菌门的细菌分类，包括Corynebacteriaceae和Micrococcaceae，主要见于非胃肠道肿瘤(图4B)，该结果与先前在乳腺癌、肺癌和卵巢癌中检测到的微生物组成的研究相一致。
此外，在种水平上也有明显的肿瘤型独特的微生物群组成。对瘤内细菌最广泛的种类(n = 137种) 的无监督聚类分析表明，其中许多物种在某些肿瘤类型中富集(图4，C-D)。之前的研究报道了Fusobacterium nucleatum在结肠癌中显著富集，而在本研究的乳腺癌和胰腺癌的队列中也有一定的富集。此外，研究者还观察到同一肿瘤类型的不同亚型之间存在明显的微生物组成差异。例如，比较不同亚型乳腺癌的雌激素受体(estrogen receptor,ER)，孕激素受体(progesteronereceptor, PR)和HER2状态，可以发现多个细菌类群其丰度比例在不同的亚型之间有所不同。虽然不同肿瘤类别内部的微生物总体组成与其的癌旁正常组织微生物的组成相对相似(图4F)，但该研究也检测到在肿瘤组织中微生物组成与其癌旁的正常组织具有分布比例不同的细菌类别(图4G)，例如，乳腺肿瘤组织中的细菌载量和丰富度均高于其癌旁的正常组织。
图4 不同的肿瘤类型微生物组成不同. (A)根据所有可能的样本对之间通过肿瘤中所有过滤器(n=528)的细菌种类的Jaccard相似性指数,热图显示了来自任何两种肿瘤类型的样本对之间的所有指数的平均值.(B)不同肿瘤类型之间的在目水平上的分布情况。相对丰度是通过将不同肿瘤类型中通过所有过滤器的物种读数相加而计算出来的，并且属于相同的顺序. (C)在一种肿瘤类型中富集并且在至少一种肿瘤类型中存在于10%或更多样本中的137种细菌的无监督分级聚类分析. (D)来自(C)图中的19种细菌在不同的肿瘤类型中比例.(E)在不同乳腺肿瘤亚型之间具有显著差异的微生物，其中HER2+(n=61)，HER2- (n=247)，ER+(n=270)，ER−(n=49)，三阴性乳腺癌(n=36)与非三阴性乳腺癌(n=284)，条带的方向指示了富集方向. (F)不同组织类型细菌种类间基于Jaccard相似性指数的PCoA分析.(G)显示乳腺、肺和卵巢样本中肿瘤及其癌旁组织之间细菌分布差异的火山图.5 瘤内细菌的代谢功能与某些肿瘤亚型的临床指征相关前面几部分的结果表明，不同类型肿瘤内细菌的种类跨度十分广泛。为了进一步研究肿瘤内细菌的功能活性，研究者使用PICRUSt2对上述细菌物种可能含有的基因和代谢途径进行了16S测序分析。对287条预测的代谢MetaCyc通路进行了无监督的聚类分析，这些通路显示不同的肿瘤类型之间的具有较大的变异性，表明某些特定微生物的代谢途径对某些肿瘤类型具有特异性(图5A)。研究发现一些肿瘤类型特异的细菌代谢途径，可以降解在该肿瘤组织中富集的代谢物。例如，降解羟脯氨酸的细菌(MetaCyc PWY-5159)在骨癌中显著富集，而骨胶原是羟脯氨酸的主要来源，许多骨骼方面的疾病，例如骨肿瘤，已被证明会导致羟脯氨酸水平升高。与其他肿瘤类型相比，甲苯、丙烯腈和氨基苯甲酸酯(甲苯-DEG-2-OH-PWY, P344-PWY和PWY-6077)等与香烟中烟雾化学物质降解有关的MetaCyc通路则显著富集在肺癌中发现的细菌。肺癌中可以降解香烟烟雾代谢物的细菌显著富集可能表明，这些高浓度的代谢物为在肺部能够降解这些代谢物的细菌创造了有利条件。为了确定这一假设，研究者比较了100名有吸烟史的非小细胞肺癌患者(NSCLC)和43名无吸烟史的非小细胞肺癌患者(NSCLC)肺部的细菌功能差异。结果发现，有吸烟史患者的肿瘤组织中显著富集的49条MetaCyc通路中，有17条是与降解香烟烟雾中发现的化学物质有关的途径，如尼古丁、邻氨基苯甲酸盐、甲苯和苯酚(图5B)。此外，该研究还发现了8条与植物可利用的代谢物生物合成有关的MetaCyc通路，例如，植物光呼吸的关键中间体甘氨酸的生物合成(图5B)。因此，研究者推测，一些与植物相关的细菌或其DNA存在于香烟中进而在有吸烟史的肺部肿瘤中富集。接下来，为了确定哪些细菌对当前吸烟者肺部肿瘤中富集的MetaCyc途径有贡献，研究者比较了吸烟者(n=100)和不吸烟者(n=43)肺部肿瘤中发现的所有细菌种类的比例。结果发现吸烟者肺部肿瘤中的细菌富集类群大多属于Proteobacteria(变形菌门)。然而，在多重假设检验校正后，这些细菌都没有达到显著性差异水平(图5C)，这表明在不同的样本间不存在具有这种功能的同源物种。该研究团队认为，虽然不同肿瘤组织的细菌生态环境不同，但吸烟者肺部的特定环境具有某些共同的功能信号。该研究可以证明，大量的异源细菌有助于香烟烟雾代谢物的降解功能和植物代谢物的生物合成(图5D)，而表达这些功能的细菌主要存在于Proteobacteria、Actinobacteria和Cyanobacteria中，而在Firmicutes中则被逐渐消耗(图5D)。此外，研究者还在某些肿瘤亚型中发现细菌功能的选择性富集。例如，与49个ER−乳腺肿瘤相比，多个MetaCyc通路富集在来自270 个ER+乳腺肿瘤的细菌(图5E)。ER+乳腺肿瘤内细菌最显着的富集途径是砷酸盐解毒和菌硫醇生物合成。砷是一种I类致癌物，可以显著增加患乳腺癌的风险，并且已经被证明可以诱导乳腺癌中雌激素受体的表达。硫醇是细菌用来解毒活性氧的物质。众所周知，与ER−肿瘤相比，ER+乳腺肿瘤的氧化应激水平增加，因此研究者假设具有合成硫醇能力的细菌可以更好地在ER+肿瘤微环境中生存。将乳腺肿瘤与NAT样本进行比较时，该研究还发现细菌功能的富集。例如，与NAT相比，与无氧呼吸相关的酶在乳腺癌组织中的细菌富集。总体而言，该研究对MetaCyc途径的分析结果表明，肿瘤中存在的细菌的功能与其所在的肿瘤微环境之间存在密切联系。最后，如前面的免疫荧光染色结果所示，在CD45+免疫细胞内发现有部分细菌的存在，这表明其可能影响或反映了肿瘤微环境的免疫状态。为了确定特定的肿瘤内微生物的特征是否与免疫治疗的反应相关，研究者比较了对免疫检查点抑制剂(ICI)有响应的患者(n=29)和没有响应的患者(n=48)的转移性黑色素瘤。虽然该研究没有发现二者之间的细菌负荷有显著变化，但确实发现与无应答者相比，应答者的黑色素瘤组织中有更多(n=18)或更少(n=28)的细菌类别(图5F)。同时，在应答者的肿瘤组织中Clostridium有所富集，而在无应答者的肿瘤中Gardnerella vaginalis则更丰富。值得注意的是，上述结果与之前报到的，在对ICI有响应的黑色素瘤患者的肠道微生物中类群丰度的差异是一致的。
图5 预测的细菌代谢功能与临床特征相关. (A) 热图显示了287个MetaCyc预测通路在不同肿瘤类型中富集的无监督分类聚集分析. (B- C)火山图，显示吸烟者(n=100)与不吸烟者(n=43)肺部肿瘤中富集的细菌的MetaCyc途径(B)和分类群(C)，采用双样本比例z检验计算P值，绿色实心圆圈表示FDR校正Q< 0.25的路径，蓝色圆圈表示烟雾化学物质的降解途径，红色圆圈表示与植物有关的代谢途径. (D)促进香烟烟雾代谢物降解(蓝环)和促进植物代谢物功能生物合成(红环)的细菌种类的分类轮线图与肺部肿瘤中的所有细菌(绿环)一起显示在系统发育树图. (D)促进香烟烟雾代谢物降解(蓝环)和有助于植物代谢物功能生物合成(红环)的细菌种类的分类轮线图与肺部肿瘤中的所有细菌(绿环). (E)火山图显示ER+与ER−乳腺癌中富集的细菌的MetaCyc功能途径. (F)火山图显示了对免疫检查点抑制剂(ICI)有应答(R)的黑色素瘤患者与无反应者(NR)中富集的细菌类群.
在本研究中，研究者对来自人类乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌和脑肿瘤的七种肿瘤组织共计1526个样本的微生物进行了系统的表征和分析，揭示了不同肿瘤类型和特定微生物之间的关联。该研究发现，在其检测的所有癌症类型的肿瘤组织中都存在有细菌，并且每种癌症中都存在着独特的细菌种群。其中，乳腺癌组织中的细菌数量和多样性最高，与正常乳腺肿瘤周围的组织相比，在乳腺肿瘤组织中可以发现更多的细菌，而且一些细菌优先在肿瘤组织中发现，而不是在肿瘤周围的正常组织中。同时证明，在这些肿瘤组织中发现的细菌是活的，并且可以定位在肿瘤细胞内的特定位置（靠近细胞核）。此外，研究还发现，细菌不仅存在于肿瘤细胞中，还存在于肿瘤微环境内的免疫细胞中。该研究还揭示了某些特定菌群可以定殖在肿瘤细胞周围以及每种肿瘤都有自己的独特菌群微环境，并将上述原因归结于不同肿瘤类型的微环境不同。同时，肿瘤组织中的细菌可以依靠某些由特定的肿瘤细胞产生的或储存在特定的肿瘤组织中的代谢产物而生存。
在世界范围内，约有超过16%的肿瘤发病率被归因于感染性病原体。越来越多的研究发现，在许多肿瘤组织中都有细菌的存在。然而受限于检测技术及分类鉴定水平，不同类型肿瘤组织中的细菌目前还没有得到全面系统的表征。肠道微生物已被证明对肿瘤得发生、发展过程有多方面的影响，以及对包括肿瘤免疫治疗在内疗效响应的影响。因此，肿瘤内部复杂的微生物的特征可能是揭开肿瘤内细菌对不同癌症特征影响的重要一步。肿瘤微环境作为一种复杂的生态系统，除了肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞、血管、神经细胞和其它成分外，该研究表明，细菌也是肿瘤微环境的一个组成部分。将该研究的分析结果进一步延伸到细菌的功能水平，结果表明尽管不同肿瘤中细菌的分类群水平有很大的差异，但某些肿瘤环境丰富了共同的、相关的细菌功能途径。与其微生物类群相比，该结果与人体肠道微生物功能的相对稳定性具有相似性。此外，研究者利用多种可视化技术和培养组学的方法，来确定肿瘤组织中细菌的分布情况，并证实其在肿瘤细胞和免疫细胞中的定位。此外，需要注意的是，该研究目前的数据暂不能确定肿瘤内细菌是否在肿瘤的进展中起到因果作用，或者细菌的存在是否仅仅反映了已有肿瘤的感染状况。随着肿瘤的不断进展，其微环境中相对不完善的新生血管系统可能会允许体循环中的细菌进入，而局部免疫抑制的微环境可能会为细菌的定殖提供进一步的有利条件。无论细菌是否在肿瘤发生中起到因果作用，进一步探讨肿瘤内细菌对不同表型的肿和免疫系统的影响及其与肿瘤细胞的相互作用都是很有意义的，正如肠道微生物的靶向调控已被证明会影响肿瘤对免疫检查点阻断治疗的响应一样。因此，深入了解肿瘤细胞和其周围环境中的微生物之间的关系可能有助于预测某些治疗的潜在有效性，或者可能为今后操纵这些细菌以增强抗癌治疗的作用指明方向。
