不同物种肾脏常驻巨噬细胞候选基因表达标签的确定
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10X Genomics测序
1.普通分群
测序准备：取组织，1 mg/ml collagenase type I(1ml RPMI1640)+100 U/ml DNase I，37℃搅拌消化30min成单细胞悬液(小鼠)，分选出CD45+免疫细胞，去除T细胞(CD3e in mouse and pig, CD3 in rat and human),B细胞(B220 in mouse, CD45RA in rat, CD19 inhuman)
测序对象：在mouse, rat, pig, and human kidney tissue中分别测得 3013, 3935, 4671,2868个细胞, The mean reads 依次是 80508, 54456, 61638, 112080
分析手段：Unbiased hierarchical clustering and heatmap analysis using Seurat
无监督聚类图：
细胞分型：通过参考文献，选已知marker来确定小鼠肾脏内部免疫细胞类型，neutrophils (Lcn2+), NK cells (Gzma+), ILCs (Il7r+), infiltrating macrophages (Ccr2+,Itgam+), resident macrophages (Adgre1+, Fcgr1+), dendritic cells (Snx22+, Batf3+) . Additional markers including Plac8, Lyz2, and Cebpb were used to identify infiltrating macrophages (Figure 1).23 以及小部分的 B cells (Cd79a+)
2.新的marker发现
聚焦Infiltrating or Resident Macrophages，使用Seurat包，做DEG分析，确定每一个类群中的表达差异性最大的基因，最终确定， uniquely expressed in Ly6c hi (Chil3, Plac8) and Ly6c lo (Fabp4, Ear2) infiltrating macrophages as well as embryonic-derived resident(C1qc, Cd81) macrophages ，如下图
新的marker的验证
实验步骤：使用FACS 分选 infiltrating (CD11bhi F4/80lo) and resident (CD11blo F4/80hi)，再用Fluidigm C1单细胞测序，进行PCA plots, violin plots, and heatmap分析。
分析结果：Fluidigm方法发现10X Genomics 发现的resident macrophage新的20个 marker中有13个是相match的，找了四种动物中Top4差异表达的基因(C1q, Cd81,Cd74,Apoe)
生物学验证：取小鼠肾脏组织的单细胞悬液，做流式分析。CD81和 CD74 is enhanced in resident macrophages (CD11blo F4/80hi) compared with infiltrating macrophages (CD11bhi F4/80lo)。C1q和Apoe对两群的区分不明显，被排除。
总结
本文主要测序不同物种(小鼠、大鼠、猪、人)的肾脏组织中的CD45+免疫细胞，鉴定出CD74/CD81为resident macrophage的新marker。可能为其他细胞寻找新marker的或者鉴定未知类群的marker提供新思路。