指南来了：分子诊断实验室的性能验证

指南解读

分子诊断实验室的性能验证

中国合格评定国家认可委（CNAS）在2019年2月15日发布了CNAS GL-039 《分子诊断检验程序性能验证指南》，该指南是对CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》以及CNAS-CL02-A009 《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》中有关分子诊断相关检验程序进行性能验证试验所做的具体解释和指导，实用性很强，解决了很多实际操作过程中的困惑，也是CNAS首次在分子诊断实验领域给出的具体工作指南。

对于基层的分子诊断实验室主要使用的实验技术是基因扩增，即PCR技术，包括定性试验与定量试验两种类型。如果实验室采用的是已经经过确认的检验程序，可以使用指南给出的方法进行性能验证。

一、性能验证时机

需要注意性能验证的时机，一般是在检验程序常规应用前。常规使用期间，实验室可基于分析系统的稳定性，利用日常工作产生的检验和质控数据，定期对检验程序的分析性能进行评价分析。新检测系统也包含现用检测系统的任一要素（仪器、试剂、校准品等）变更，如试剂升级、仪器更新、校准品溯源性改变等，都应当按照新系统来进行验证。

二、性能验证参数

PCR定量检测选择验证的性能指标宜包括测量正确度、测量精密度（含测量重复性和测量中间精密度）、测量不确定度、分析特异性（含抗干扰能力）、分析灵敏度、检出限和定量限、线性区间（可报告区间）等。PCR定性检测选择验证的性能指标宜包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等。

三、性能验证方案

1. 定量PCR

分子诊断定量检测项目的性能验证可参照CNAS-GL037 《临床化学定量检验程序性能验证指南》。

2. 定性PCR

（1）方法符合率

通过与参比方法比较来验证符合率。参比方法包括但不限于：金标准方法、行业公认方法、经验证性能符合要求满足临床预期用途的方法（如：通过ISO15189认可实验室使用的相同检测方法）。选取阴性样本至少5例、阳性样本（宜包含弱阳性/低扩增的样本）至少10例。采用参比方法和候选方法平行检测。可采用2*2列联表的方式汇总数据（如下图所示），计算符合率：阳性符合率=[A/(A+C)]×100%；阴性符合率=[D/(B+D)]×100%；总符合率=[(A+D)/N]×100%。实验样本例数有限时，应尽可能保证100%符合，样本量较大时可用卡方检验判断候选方法与参比方法的一致程度。

（2）检出限

所用检验程序在厂家试剂盒使用说明书中声明检出限时，检测项目在有标准物质时，或以定量形式表达定性结果时，应进行检出限的验证。使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，可重复测定5次或在不同批内对该浓度样本进行20次重复测定（如测定5天，每天测定4份样本。稀释液可根据情况选用厂家提供的稀释液或阴性血清，该阴性血清除被验证的目标物必须阴性外，所含干扰物质 浓度必须在厂家声明的范围之内。5次重复检测，必须100% 检出靶核酸；如果是20次检测，必须检出至少18次靶核酸。

（3）交叉反应

对于病原体核酸检测，取一定浓度与待测核酸可能存在交叉反应的病原体加入样本保存液或经确认为阴性的样本中，至少重复检测3次；对于基因型检测，取一定浓度经其它方法（如测序等）确认为其它基因型的样本，至少重复检测3次。结果为阴性即验证通过。

（4）抗干扰能力

分子诊断常见的干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子和药物等。可在弱阳性样本中加入干扰物质溶液，干扰物质的终浓度与厂家声明的浓度相同，重复测定3次以上，检测结果仍为弱阳性验证通过。也可选取含高浓度水平干扰物质且经确认不含被测物的临床样本，在其中加入弱阳性样本（量小于10%），重复检测3次，检测结果仍为弱阳性即验证通过。

总之，分子诊断实验技术发展迅速，检测项目、实验方法日渐多样，实验室应在新的检验程序投入使用之前把好性能验证这一关，根据实际情况，参考标准指南，将验证方案系统化，程序化，尽可能达到开展此类检验项目的预期用途。

作者简介：裴世静，山西省临床检验质量控制中心