综述 |肠道微生物组研究的重点是什么？（第四期文献包投票选出的文章）
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有很多因素影响着人类，小鼠和其他哺乳动物的微生物组，但哪些因素在研究中具有重要意义还是无法确定的。本综述主要论述了影响微生物组的因素，并且认为明确考虑并量化微生物组研究中的效应大小，可以更好地设计因素混杂的实验。
原名：Tiny microbes, enormous impacts: what matters in gut microbiome studies?
译名：小小的微生物，巨大的影响：肠道微生物组研究的重点是什么？
期刊：Genome Biology
IF：41.058
发表时间：2016年
通信作者：Rob Knight
通信作者单位：Department of Pediatrics, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA
1 影响微生物组的生物因素
考虑微生物组研究中自然发生的生物学变异的影响是非常重要的，当选择对照组和样本量时，必须考虑不同生物效应（例如，由饮食，药物或疾病引起的微生物组变化）和技术效果（例如，PCR引物或DNA提取方法的影响）给实验带来的影响。迄今为止，已观察到对微生物组具有影响的生物因子如表1所示。
表1 生物协变量影响微生物组的相对影响
许多研究表明，肠道微生物群落的组成与饮食有很大差异。人的一生中，肠道菌群时动态变化的，其变化与饮食变化相关。此外，相对于婴幼儿时期，成人期的肠道菌群变化要相对小的多。生命早期肠道菌群的这种变化与饮食相关，但很难将饮食和其他因素引起的变化分开。
生命早期，婴儿微生物组经历了快速的变化，其中变化与母乳组成和母乳微生物组的变化相关。喂养方式的不同也会导致婴儿微生物组的不同，同母乳喂养的婴儿相比，母乳配方喂养的婴儿的微生物群落更接近于成人的微生物群落。固体食物的引入与微生物组的变化也密切相关。在这期间，幼儿的微生物组更接近于他们的父母的微生物组。研究表明婴儿微生物组和成人微生物组之间的差异要大于研究中技术效应所导致的差异，这说明婴儿和成人之间的这种差异是对人类肠道微生物群落的最大影响之一。
儿童和成人肠道微生物组的变化可能源于与时代相对应的饮食变化，包括从狩猎时代转变为农业或工业化时代。但是，我们难以分清这种变化是由饮食所致还是其他因素例如抗生素所致。虽然抗生素的使用会导致菌群之间有差异，但不同的个体对抗生素的反应也是不同的。在这种情况下，测序平台或试剂污染所带来的差异就要小于生物效应，并且还可以使用序列数据处理和统计技术对其进行校正。然而，复合效应可能导致研究之间的差异要大于所检测的生物学效应。PCoA分析提供了一种快速可视化技术，用于评估哪些影响较大，哪些影响较小。通过PCoA分析我们可以清楚的看到菌群的分离，通常来说，导致样品组在PCoA空间中分离更多的因素具有更大的影响。一个重要的警告是：距离度量的选择会对此聚类会产生很大的影响。
在小范围内，例如仅考虑西方人口时，个体饮食对微生物组的影响不太明显。已有研究表明，长期饮食模式可以改变微生物组。但是，将长期膳食模式与塑造个体微生物群落的其他因素分开可能很困难。例如，假设运动改变微生物组。一项研究发现极限运动员与年龄和体重匹配的对照之间存在差异。然而，目前尚不清楚这些差异是由于剧烈的训练方式，运动项目的饮食要求，还是这两个因素的综合作用。在该比例下，数据可能在PCoA空间中重叠。
宿主遗传学有助于塑造微生物群落。研究已表明同卵双胞胎的整体微生物群落比异卵双胞胎更相似一些。此外，细菌和人类祖先的共同进化也会影响疾病风险：Helicobacter pylori菌株的转移可能会带来更高的胃癌风险。然而，将遗传学的影响与母亲与孩子的垂直传播的影响或由于与年龄较大的孩子同居而转移的影响分开可能是困难的，并且这些因素的相对影响大小是未知的。
同居和宠物也可改变微生物群落，它们的影响可能与饮食（通常在家庭内共享）混淆。 配偶有时被用作对照，因为他们被假设有类似的饮食。 然而，与没有共同生活的夫妇相比，共同生活的夫妻可以分享更多的皮肤微生物组，并且在较小程度上分享他们的肠道微生物组。狗的存在也会影响皮肤的相似性，但不影响肠道菌群。
接触抗生素以外的化学物质也会影响我们的微生物组，微生物可能反过来影响我们对这些化学物质的反应。越来越多的证据表明，使用药物-非处方药和处方药都会导致微生物群落结构的变化。例如，二甲双胍的使用与瑞典和中国成人II型糖尿病微生物组的变化相关。（值得注意的是，在这项研究中，未能证明与两个群体中的疾病相关的生物标志物是由于二甲双胍的使用不同，这对微生物组有很大影响;此外，该药物仅用于糖尿病病例而不是在健康对照中。）微生物组的变化也可能与化学物质特定的副作用有关;例如，二甲双胍的使用不仅改善了葡萄糖代谢，还改善了导致气体和肠道不适的途径。利用现有数据难以解决这些因素中哪一个对微生物组变化的贡献最大。
对于一个个体来说，短期或长期干预措施具有最大的治疗潜力，但干预措施的影响往往各不相同，方法也很重要。 在一项观察高纤维或低纤维饮食的微生物组变化的研究中并没有发现明显差异。一个专注于主要是肉食或大多数植物性饮食的群体只有在考虑菌群结构的相对变化时才发现菌群结构的差异，并且没有发现来自不同人群的群体总体上有一个共同的状态。
2 影响微生物组的技术因素
技术的变化对微生物群落结构具有很大的影响，通常接近于或大于生物因素对其的影响。对于技术因素，主要考虑的因素包括样品采集和储存技术，DNA提取方法，扩增区和PCR引物的选择，测序方法和生物信息学分析方法（图1，表2）。
图1 PCR引物中的PCoA差异可以超过不同的人同个部位之间的差异，但不会超过同一个人不同身体部位之间的差异。
表2 影响微生物组的技术因素
微生物组研究首先考虑的是样品采集和储存。可以直接使用粪便样品或来自用过的卫生纸的拭子收集粪便样品。微生物储存的黄金标准是在-80°C下冷冻样品。最近的研究表明，在室温下长期储存可以改变样品的稳定性。还有另外一些保存方法，如粪便隐血试验卡，用于结肠癌检测，或者与防腐剂放在一起，也是更好的选择。在储存过程中，应该尽量避免反复冻融，因为它们会影响再现性。不仅是反复冻融，研究发现一些保存缓冲液也可改变观察到的菌群结构。样品储存方法对菌群结构的影响虽然没有个体差异带来的影响大，但远大于样品采集的方法所带来的影响。
样品的处理对观察到的微生物群也起着重要作用。DNA提取的质量不同会对其造成影响，DNA片段和引物的选择也会造成偏差。PCoA分析表明不同引物区域的选择带来的影响大于研究中的任何生物效应（图2）。此外，测序技术的选择也对观察到的菌群结构产生影响。较长的reads可以提高分类准确度，但前提是测序技术不会引入额外的错误。
图2 PCoA技术和生物变异模式
数据处理的选择在一项研究的结果中也发挥着作用。片段的修建对于研究正常化是非常重要的，但较短的reads可能也会影响分类的准确性。将序列映射到微生物中的方法的选择对所鉴定的微生物群落有很大的影响。在这些方法中，基于某个阈值将序列聚类到操作分类单元（OTU）中的方法是最常见的。序列可以针对自身聚类，针对参考聚类，或者针对两者的组合聚类。特定OTU聚类方法和聚类算法的选择都会改变观察到的微生物群落，并且可以人为地增加观察到的OTU的数量。降噪（通常用于454测序的技术），PCR期间产生的嵌合序列的去除以及Illumina数据的质量过滤可以帮助减轻这些问题中的一些。OTU挑选，生物标准，生态指标和统计检验的不同都可以得出不同的生物学结论。
技术变化影响生物学结论的程度取决于效应的相对规模和比较方法。对于非常大的效应，即使存在技术变化，当研究结合时，生物学相关的模式也可以是可再现的。目前来看，一些研究中许多生物效应对观察到的微生物群落的影响小于研究中常见的技术差异。
倘若不考虑技术的差异的话，对产生的生物学判断可能会造成影响。在低生物量样品中，诸如试剂污染的技术混杂因素可能比生物信号具有更大的影响。例如对来自幼儿的鼻咽样品的纵向研究。在研究中，PCA分析发现了年龄的明显区别。然而，后来确定样品是用两个不同批次的试剂提取的。事实上，微生物群落的差异是由于试剂污染而非生物学差异导致。较高的生物量样本也不可避免这个问题。使用两种不同的方法提取样本和对照样本可能会导致类似的错误结论。
3 比较效应：大型综合研究的重要性
大规模的整合为比较效应提供了一个通用框架。大型群体研究通常可以成功地捕获生物模式的重点，例如年龄，人类微生物组成或克罗恩病等特定健康状况。大型群体规模意味着在同一组样本中多种效应也可以被比较。例如，HMP提供了西方成年人体内微生物多样性参考图。Yatsunenko等人强调年龄对微生物的影响大于其他因素（包括体重和国籍）的影响，而国籍的影响比体重更大（图3）。
图3 生物协变量对人类微生物组的相对效应大小
最近发表的两项关于比利时和荷兰人群的研究提供了非常有趣的例子，主要说明了更大规模的人群研究可以实现什么，了解哪些因素对于构建微生物组时很重要。
在LL-Deep研究中，通过16S rRNA扩增子测序和鸟枪法分析1135名荷兰人，并将110个宿主因子与由鸟枪法鉴定的125种微生物物种相关联。这项研究发现，年龄，大便次数，饮食变化如总碳水化合物，植物和水果，碳酸饮料（“饮食”品牌和糖类）都有很大影响，质子泵抑制剂，他汀类和抗生素等药物也是如此。有趣的是，作者观察到鸟枪法和16S rRNA扩增子结果之间高达90％的一致性，这表明虽然不同方法特定分类群不同，但关于重要微生物效应的许多结论可能对某些方法学变化具有鲁棒性。Flemish Gut Flora项目通过使用16S rRNA扩增子测序分析1106人，确定了与微生物组相关的69个变量，包括使用的13种药物，从抗生素到抗抑郁药，并解释了在微生物组中存在的7.7％的变异。粪便的一致性（代表运输时间），年龄和体重指数对微生物的影响很大，饮食中的水果频率有影响。但是，成年受试者未显示早期生活变量对微生物的影响，例如儿童早期的分娩方式或居住类型。美国肠道项目（www.americangut.org）现已处理超过10,000个样本，以评估限制较少的健康和生活方式对西方人群微生物多样性的影响。这种大规模研究有两个比较优势。它们可以帮助限制技术变异性，因为同一研究中的样品以相同的方式收集和处理。这减少了技术混淆因素，使得更容易得出生物学结论。其次，大规模人口研究增加了发现微小生物效应的可能性，这些效应可能在较小研究的降噪中丢失。
将较小研究纳入这些较大研究背景的Meta分析也可以为较小研究中所见变化的相对大小提供新的见解。Weingarden等利用HMP对粪便物质移植（FMT）的动态进行了背景化。他们的初始数据集集中在四名患有复发性艰难梭菌感染的患者和一名健康供体者的时间序列中。通过将时间序列结果与更大的数据集相结合，他们的结果表明在粪菌移植后患者得到了显著恢复，并最终帮助患者从严重的艰难梭菌感染中恢复健康。
然而，在进行Meta分析时，重要的是要考虑不同研究中微生物群落的差异是否归因于技术或生物效应。选择每个包含生物学相关对照的研究可以帮助确定研究结果之间效应的比例是由生物因素还是技术因素产生的。例如，婴儿微生物组在生命最初2年内的进展的研究显示婴儿微生物组随着年龄而变化，但只有当这项研究被置于HMP的背景下时，婴儿身体不同部位发育变化的规模才明显大于不同婴儿相同部位之间微生物差异变化的规模。
4 在Meta分析中杠杆效应的大小
与其他领域相比，微生物组研究中的Meta分析仍处于起步阶段。统计方法可以帮助克服直接比较中技术效果的复杂性，从而可以专注于生物学结果。医学药物试验通常报告量化的效应大小。这种做法有几个优点。首先，它远离了在P <0.05时不显著或显著的普通二元范式。正如在其他领域所示，显著性和效应大小的组合对于避免过度担忧是重要的。例如，最近的一项Meta分析发现，与红肉消费相关的癌症风险显著增加。然而，与肉类消费相关的结肠癌的相对风险远低于与炎性肠病（IBD）诊断相关的结肠癌的相对风险。仅使用P值，可能无法确定哪个因素对癌症风险的影响更大。效应大小的量化还可以帮助捕获不同人群之间效应的变化范围：微生物群落可能存在多种“病态”方式，而不是因某种特殊人群只有单一菌群增加或降低。例如，我们在不同的“肥胖”微生物组中看到了这一点，这些微生物组似乎是不同肥胖群体的特征。最后，效应大小也与统计功效或揭示统计差异所需的样本数量密切相关。定量功效评估可以改善实验设计并限制实验结果偏差。
不幸的是，效应大小和统计功效在微生物组数据中计算是具有挑战性的。 目前，应用功效计算通常会对微生物群落分析中不适用的数据做出假设（BOX 1）。针对该问题已经提出了一些解决方案，包括用于OTU的Dirichlet多项式方法和随机森林分析，用于基于PERMANOVA的β多样性比较的基于仿真的方法，以及通过子采样的功效估计（BOX 1）。 然而，在微生物组研究中，功效分析仍然很少。 这些新方法也可以促进更好地理解效应大小。 随着微生物组研究的范围不断扩大，包括代谢组学，宏基因组学和元转录组学数据，效应大小的考虑将变得更加重要。
BOX 1
5 研究设计考虑的因素
大规模的研究可以深入了解哪些变量对微生物组具有广泛影响，但它们并不总是可行的。为了解决某个小问题而设计的小型，精细的研究具有推动该领域发展的巨大潜力。 在设计这种研究时，最好是狭义地定义一个感兴趣的群体，而不是试图得出一般性结论。小型研究的设计和实施应该追求四个目标：有限的研究重点，丰富的元数据收集，适当的样本大小和最小化的技术变化。
研究范围的限制增加了小型研究成功的可能性，因为它减少了混杂因素。 例如，“牛奶消费改变儿童微生物群落结构和丰富度”的假设可以更好地表达为“牛奶消费影响在纽约公立学校上三至五年级的儿童的微生物群落结构和丰富程度”。 此外，该研究应定义排除标准; 例如，也许应该排除在过去6个月或1年内服用过抗生素的儿童。在Meta分析中可以更好地解决更广泛的假设，其中可以组合关于类似主题的多个小型，精心设计的研究。
研究范围的第二个考虑因素是确定目标样本量。可用其他的研究作为指导，特别是如果数据可用于量化效应的大小。定量功效计算（框1）在定义样本量方面特别有用。不过，这种比较应该明智地进行。应通过选择具有相似比例的已知效果来估计样本量。与效应相关的表型以及效果是否可能直接针对目标微生物都是需要谨慎考虑的。例如，一种抑制叶酸代谢的新药可参与细菌和真核生物中的DNA修复，人们就会猜测这种新药可能具有与其他具有遗传毒性的药物（例如特定类别的抗生素和抗癌剂）相近的作用。
应尽量减少研究中的技术变化。 样品采集和储存都应标准化进行。 在收集后一天内不能冷冻样品的研究应考虑采用保存方法，即使保存的样品也应在
-80°C下冷冻以备长期保存。如果可能，应使用相同的试剂一起处理样品。如果由于研究的规模而无法做到这一点，那么样本应该随机化，以尽量减少技术和生物变量的混淆。操作流程标准化，如地球微生物项目所描述的那些，可以促进Meta分析的数据聚合。参与标准化工作，例如微生物组质量控制项目（http://www.mbqc.org/）和统一微生物组计划，可以帮助确定lab-to-lab
变化的来源。
微生物组研究正在迅速发展，尽管在其他领域已经解决了一些挑战，包括流行病学，生态学和人类基因研究（特别是全基因组关联研究），但还是需要充分解决。首先，技术变化仍然难以比较所要求的效应大小，或确定特定菌群与特定表型的关联。方法的标准化，包括生物信息学协议，是非常重要的。这对于人和动物模型之间的转化研究尤其是一个问题，因为很难确定微生物群落或宿主对这些变化的反应是否因寄主生理上的差异或爱好的不同而不同。然而，来自高通量动物模型（如苍蝇或斑马鱼）得到的微生物组结果，对人类来说其潜在的收益是巨大的。
在这篇综述中，我们主要关注16S rRNA扩增子分析和鸟枪法研究，因为这些在目前的文献中最常用的方法。微生物组研究正在不断扩大，因此单项研究可以包括多组学技术，如元转录组学，元蛋白质组学和代谢组学。在我们开始探索多组学数据集之前，尽管这种标准化工作需要相当大的成本，但是为了促进可靠的生物学结论，跨多个平台的方法标准化将是必要的。
总体而言，该领域正在汇总关于微生物组有什么作用和无关紧要的结论：改进的标准和方法学将极大地加强我们整合和相信新发现的能力。
在这篇综述中，首先详细的讲述了对微生物组有影响的生物因素，例如饮食，宿主遗传，抗生素，环境等等。其次是技术因素，例如样本采集，保存，处理和技术等都会对微生物造成影响。然后，本综述讲述了大型研究的重要性，在研究中要权衡效应的大小，不能单看某一种效应。最后讲解了实验设计应该考虑的因素。该综述非常详细，对于研究微生物的科研人员来说应该会有帮助。小编能力有限，如有不足之处，还请指出，大家多多交流。感兴趣的朋友可通过查看原文了解更多。