科研 | 膳食纤维缺乏，肠道菌群降解黏膜屏障并促进病原体感染
一、导读
尽管摄入膳食纤维对健康有好处已经众所周知，但膳食纤维缺乏对肠道菌群的影响以及对疾病风险改变的机制知之甚少。本研究使用定植人类肠道已知的几种共生菌种的无菌小鼠模型，阐明了膳食纤维、肠道菌群和结肠黏液屏障之间的功能交互作用，（这）是预防肠道病原的主要防御手段。在长期或间歇性膳食纤维缺乏的情况下，肠道微生物群以寄主的黏液为营养来源，导致结肠黏液屏障的侵蚀。用柠檬梭杆菌感染小鼠，膳食纤维缺乏加上肠道菌群侵蚀黏膜，促使更多病原菌进入肠上皮并促成致命性结肠炎。本研究揭示了连接饮食、肠道菌群和肠道屏障功能障碍的复杂途径，可以利用这些途径通过饮食疗法来改善健康状况。
这项研究直观地模拟了肠道菌群在缺乏食物的情况下，以宿主物质为食物的情景，提示宿主一直积极地抵御肠道微生物，饮食也是其中的一种方式。
二、论文ID
原名：A Dietary Fiber-Deprived Gut Microbiota Degrades the Colonic Mucus Barrierand Enhances Pathogen Susceptibility
译名：膳食纤维缺乏可导致肠道菌群降解粘膜屏障并促进病原体感染
期刊：Cell
IF：30.410
发表时间：2016年
通讯作者：MaheshS. Desai1,2,Eric C.Martens2
通讯作者单位：
1.Luxembourg Centre for Systems Biomedicine
2. University of Michigan Medical School
三、实验设计
实验假设：
在膳食纤维缺乏的情况下，肠道微生物群以寄主的黏液为营养来源，导致结肠黏液屏障的侵蚀，进一步增加病原体感染的几率。
动物模型的制备：
使用无菌小鼠模型制备了人源化的小鼠模型：导入无菌小鼠图1-A所示的14种经测序已知的菌种(SM)，分属于5个菌门——拟杆菌门（5）、厚壁菌门（5）、放线菌门（1）、普雷沃氏菌门（1）、疣微菌门（1），分别是——卵形拟杆菌、单行拟杆菌、多形拟杆菌、粪拟杆菌、Barnesiella intestinihominis、Roseburiaintestinalis、直肠真杆菌、普拉梭菌、Marvinbryantia formatexigens、共生梭菌、产气柯林斯菌、大肠杆菌Hs、Akkermansia muciniphila、Desulfovibriopiger。
体外采用42种植物和动物来源的单糖和多糖培养，包括粘蛋白聚糖，已表明具有降解能力。（图1-A）连续三天灌胃人源菌种（SM），连续14天采用含15%膳食纤维的标准高膳食纤维饮食喂养，通过q-PCR进行微生物定植的鉴定（图1-B）。
喂食策略及取材（图1-B, 1-C）：
对照组：无菌小鼠
实验组：定植SM小鼠，分为7组，分别采用不同的饮食策略
实验组1：高膳食纤维饮食
实验组2： 缺乏膳食纤维饮食
实验组3：益生元饮食(益生元为等比例的14种宿主不可消化的多糖)
实验组4：高膳食纤维饮食/缺乏膳食纤维饮食隔日更换饮食
实验组5：高膳食纤维饮食/缺乏膳食纤维饮食隔4日更换饮食
实验组6：益生元饮食/缺乏膳食纤维饮食隔日更换饮食
实验组7：益生元饮食/缺乏膳食纤维饮食隔4日更换饮食
图1 人工组合的人类肠道菌群所利用的碳水化物及无菌小鼠处理
四、实验结果
1.长期或间歇性膳食纤维缺乏会增加粘液降解细菌的丰度
饮食缺乏膳食纤维组（FF），四种微生物——A. muciniphila, B. caccae, B.ovatus, E. rectale丰度迅速发生变化，A. muciniphila和B. caccae可以降解粘液多糖，膳食纤维缺乏的情境下迅速增加，B. ovatus和 E. rectale不能代谢黏液多糖，但共同点是都可以降解多种膳食纤维。缺乏膳食纤维的情境下，膳食纤维降解菌丰度下降。黏液降解菌在盲肠、结肠腔以及粘液层的丰度变化均表现出了一致性（图2-E）。无论是膳食纤维缺乏组（FF）还是间歇性膳食纤维缺乏组 均表现为一致的结果——即A. muciniphila和B. caccae均显著增加。其他种类的细菌也有丰度的改变，程度较小。
益生元组（Pre），饮食中仅添加了一种多糖，表现出类似FF组菌群变化，因此，添加单一多糖饮食对于菌群结构影响不大。
图2 复杂膳食纤维的缺乏导致了黏液降解细菌的增殖
2.膳食纤维缺乏，RNA 水平和酶水平数据显示黏液的降解增强
在膳食纤维缺乏的情境下，降解黏液的细菌丰度增加，猜测这种增加是因为肠道菌群将黏液作为营养进行代谢生存。为了检验此猜测，检验了定植菌群的碳水化合物活性酶——一类能够降解膳食纤维和黏膜多糖的酶。
基因组注释结果表明，本研究中定植的14种微生物具有的碳水化合物活化酶种类接近于先前报道的人类肠道菌群酶的结果（96/122）。这一结果也表明，本研究所采用的定植菌的组合可以很好的模拟研究肠道菌群的碳水化合物利用。在这96种酶中，38种（加M60样蛋白酶）可以降解黏液糖蛋白(图3-A)。
在FR/FF或Pre/FF组，可以降解黏液蛋白的酶的编码发生着显著的变化，FF组和Pre组显著增强。转录组数据显示，喂食富含膳食纤维组分解膳食纤维多糖的酶更丰富，缺乏膳食纤维组在宿主肠道黏液层中黏液多糖分解酶增加。与体外生长实验和16S测序结果一致，B.ovatus 和 E.rectale富含植物多糖分解酶，四种体外能够分解黏液多糖的微生物（B.thetaiotaomicron,B.caccae, Barnesiella intestinihominis, A.muciniphila,图1-A）体内是主要的宿主多糖降解菌。
为了进一步理解B.caccae和A.muciniphila体内降解黏液多糖，我们使用提取自猪胃黏液的MOGs对这两种细菌进行了转录分析。在以MOGs作为唯一碳源时，B.caccae 和A.muciniphila分别活化表达了82个和58个基因。接下来研究组检测了与O-聚糖反应相关的基因，结果与我们的假设相一致。膳食纤维缺乏组B.caccae和A.muciniphila此类基因表达上调。在膳食纤维缺乏的情境下，A.muciniphila仅是增加了黏液分解相关的酶的基因表达，包括2种酶，而未改变其利用底物；B.caccae而是通过增强表达230个基因，包括了27个酶。
结肠黏液多糖包含明显区别于膳食纤维的糖苷酶，并可与硫形成酶。研究组通过检测相关酶发现，缺乏膳食纤维组黏液多糖相关的糖苷键（硫酸酯酶和α-岩藻糖苷酶）表达上调，纤维多糖相关的糖苷键（B葡糖苷酶）下调，而其他非特异性酶没有显著的区别变化（图3-C）。
总的来说，转录组和酶分析支持了一个结论，即在缺乏复杂植物纤维的情况下，肠道菌群协同作用并逐步表达CAZymes、硫酸酯酶和蛋白酶来攻击黏液多糖。
图3 饮食中碳水化合物活性酶表达的变化揭示了从纤维到黏液降解的群落变化
3.膳食纤维缺乏导致肠道菌群降解宿主肠黏膜屏障
黏液层是一种动态屏障，通过杯状细胞的分泌活动不断补充。研究组认为，如果细菌摄入的黏液源营养超过了新产生补充的，这一临界屏障的完整性可能会受到损害。为了探究这种可能性，对从近端结肠到直肠进行了结肠黏液层的蓝染厚度测量。同时，使用a-Muc2抗体免疫荧光染色进一步验证了黏液层厚度。为了解决黏液厚度变化直接受饮食习惯影响的可能性，我们测量了在无菌喂养的无菌小鼠中黏液层厚度作为对照。黏液厚度测量的结果发现，喂食富含膳食纤维组黏液厚度最大，其他组（包括无菌小鼠组）厚度明显低于FR组。值得注意的是，FR组比FF组的黏液厚度多5-6倍。
为了检测FF组黏液物质是否发生了变化，检测了参与构建和调节黏液屏障的几个关键蛋白质的转录水平，包括Muc2，Muc5ac，Tff1，Tff3和Klf3。Muc2表现出与膳食纤维缺乏显著的相关性，提示宿主的补偿性反应，以抵消在这组中增加的细菌黏液降解，其他几个基因无显著不同。蓝染结果也支持了这一基因表达的结果，FF组的还没有分泌出糖蛋白的结肠杯状细胞的数量与此结果相一致。
正如预期的那样，FF组荧光标记的肠道微生物更接近肠道上皮降解的黏液层使发光细菌 (图4-B)，这可能会引发有害的影响或其他的宿主反应。宿主层面的三个指标变化为这一有害变化提供依据——粪便脂质运载蛋白，表征低度炎症，FF组相比FR组增加（图4-E）；结肠长度，FF组更短（图4-F）；盲肠组织的全转录组分析表明膳食纤维缺乏，免疫反应有变化（图4-G）。
尽管没有病变表现，膳食纤维缺乏表现出明显的黏液屏障损坏以及宿主肠道反应的改变。
图4 菌群介导的对结肠黏液屏障的侵染及宿主反应
4.膳食纤维缺乏，肠道菌群促进病原体易感性
假设与方法：
因为黏液层隔离共生微生物和入侵病原体的一个重要屏障，假设在低纤维条件下，与微生物群活动有关的厚度减少会增加病原体的易感性。为了检测这一假设，用鼠柠檬酸杆菌（必须穿过黏液层进入上皮细胞引起结肠炎）进行病原体感染实验。前期的一个研究，Muc2-/-突变鼠感染后可引发严重的结肠炎，突出显示粘液层是这一病原体的一个重要的初始屏障。因此，我们在使用鼠柠檬酸杆菌感染FF组和FR组。为了消除饮食的不同对病原菌感染的影响，另外设了喂食FF的无菌小鼠和喂食FR的无菌小鼠组。收集感染后每天的粪便样品，采用16s测序和直接选择计数方法进行病原菌定植的统计。在以上实验的基础上，假设炎症反应增加是因为微生物降解黏液层导致的。为了炎症这一假设，采用荧光标记的Cr菌感染四组小鼠，在感染的四天后，生物荧光成像和透射电镜观察结肠的Cr菌情况。
结果：
定植了14种微生物的两组在Cr感染后，Cr定植逐渐增加，FF组（SM+Cr）显著增加到10倍之多；两组GF组小鼠均有高水平的Cr（图5-A）。FF组（SM+Cr）体重发生显著下降，表现出身体蜷缩、活动度减小的现象，其他三组无此现象（图5-C）。
免疫组化结果显示，与FR组（SM+Cr）相比，FF组（SM+Cr）结肠和盲肠具有更强的炎症反应（图5-E,F,G）,而直肠处的炎症差距小一些。相比定植鼠，无菌小鼠的两组炎症反应更小。为了检测是否是病原菌感染后增加黏液厚度导致炎症反应减小的假设，测量了其黏液厚度，结果表明，病原菌定植增加黏液厚度，同时，高膳食纤维导致的黏液厚度增加的优势仍然显著。
图5 缺乏纤维时肠道菌群对柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）导致致命性结肠炎起促进作用
生物荧光成像结果表明，FF组比FR组（SM+Cr）的Cr菌更接近结肠组织（图6-C,D）,透射电镜的结果也进一步支持这一结果（图6-E）。无菌小鼠组和FF（SM+Cr）具有相似的高细菌附着（图6-D）。
图6 缺乏纤维时肠道菌群促进柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）更快地进入结肠上皮
综上所述，这些结果表明，病原体能更快速地在GF小鼠和FF饮食的小鼠中穿过薄薄的结肠黏液层。然而，在增加病原体接触的环境中共生菌群与病原菌一起引起更严重的疾病，可能是通过引发共同的炎症反应。
五、研究结论
膳食纤维的正常摄入有助于防止肠道菌群对肠道黏液屏障的侵蚀，抑制病原体感染，减少结肠炎的发生。
本文由微生太群友创作，江舜尧编辑。可联系江舜尧（微信二维码见本文末）获取免费转载权限；没有获得授权不能转载。
如何快速学习宏基因组数据分析？可以参加我们的数据分析培训班！
详细点击：
（2）实用微生物组学信息分析精品班通知（11月27-30日）