科研 | AEM：可溶性纤维饮食增加肠道脆弱拟杆菌菌群丰度和免疫球蛋白A的产生
编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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免疫球蛋白A (IgA)是肠道粘膜抵御有害病原体的重要屏障。先前的研究表明，拟杆菌门(Bacteroidetes)与厚壁菌门(Firmicutes)是肠道的主要微生物，会影响IgA的产生。然而，负责IgA产生的拟杆菌属物种的相对丰度还不是很清楚。
本研究通过基于hsp60的拟杆菌属物种分布概况鉴定一些与肠道IgA诱导相关的特定拟杆菌属物种。可溶性高纤维饮食(sHFD)喂养的小鼠大肠固有层中，IgA水平和编码活化诱导胞苷脱氨酶(AID)基因的表达增加，该基因对IgM到IgA的类转换重组至关重要。在sHFD和正常饮食喂养的小鼠中，B. acidifaciens是最丰富的拟杆菌物种。此外，肠道IgA水平与脆弱拟杆菌类群的相对丰度有关，例如：Bacteroides faecis, Bacteroides caccae和 Bacteroides acidifaciens。相反，在喂食不溶性高纤维饮食和不喂食纤维饮食的小鼠中，B. acidifaciens与其他拟杆菌门菌群的比例降低。为了研究B. acidifaciens是否会增加IgA产量，用B. acidifaciens单独定殖无菌小鼠，发现其肠道IgA产量和AID表达有所增加。总的来说，可溶性膳食纤维增加肠道脆弱拟杆菌(如 B.acidifaciens)的比例，增加IgA的产量。这可能改善肠道免疫功能，保护肠道病原体，减少炎症性肠病的发生率。
论文ID
原名：A Soluble Fiber DietIncreases Bacteroides fragilis Group Abundance and Immunoglobulin A Productionin the Gut
译名：可溶性纤维饮食增加肠道脆弱拟杆菌菌群丰度和免疫球蛋白A的产生
期刊： Applied and Environmental Microbiology
IF：4.007
时间：2020.06
通讯作者：Akihito Nagahara
通讯作者单位：日本东京顺天堂大学医学院胃肠病学系
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实验设计
首先饲喂野生型小鼠ND（含有大约2%的膳食纤维）或NFD（含有0%的膳食纤维）检测大肠固有层(LILP)中IgA+ B220+细胞和IgA+ B220 -细胞，研究膳食纤维是否会影响肠道中IgA+细胞的诱导。接下来，给野生型小鼠喂食含有10％菊粉的sHFD，含有10％纤维素的iHFD，NFD或ND 3周，然后测量LILP中IgA + B220 +细胞的频率，研究哪种类型的膳食纤维（可溶，不溶或两者兼有）影响LILP中肠道IgA产生。对饲喂3周不同纤维饮食（sHFD，iHFD，NFD和ND）的小鼠大肠肠道内容物进行基于hsp60的特征分析，确定sHFD增加拟杆菌属中所包括的细菌种类。为了确认B. acidifaciens的诱导是否实际上取决于可溶性纤维饮食，在前两周给小鼠喂食sHFD或NFD，然后在接下来的两周改用另一种饮食。评估肠道IgA水平与NFD，sHFD，iHFD和ND喂养的小鼠中拟杆菌属的相对丰度之间的相关系数。最后应用无菌小鼠，研究B. acidifaciens是否增加肠道IgA产生，分析B. acidifaciens在体内产生的代谢物对增加IgA和上调肠道内的AID表达是否有作用。
实验结果
1.膳食纤维影响LILP中IgA+ B220+细胞的数量
分泌IgA的IgA +细胞在PP中发育，然后移至固有层。首先研究膳食纤维是否会影响肠道中IgA+细胞的诱导。为了解决膳食纤维的影响，喂给野生型小鼠ND（含有大约2%的膳食纤维）或NFD（含有0%的膳食纤维）。在大肠固有层(LILP)中检测IgA+ B220+细胞和IgA+ B220 -细胞。NFD喂养小鼠LILP中IgA + B220 +细胞的频率显著低于ND喂养小鼠（图1A和B），而IgA + B220-细胞的频率在ND和NFD喂养小鼠之间没有差异（图1C）。另一方面，ND和NFD喂养小鼠小肠固有层（SILP）中IgA + B220 +细胞的频率没有差异（图1D）。此外，在ND和NFD喂养的小鼠中，PPs，肠系膜淋巴结（MLNs）和脾脏中IgA + B220 +细胞的频率没有差异（图1E至G）。这些结果表明，膳食纤维会影响LILP中IgA + B220 +细胞的数量，但不会影响IgA + B220-细胞的数量。另外，对SILP，PP，脾脏和MLN中IgA + B220 +和IgA + B220-细胞的数量也没有影响。这些结果提出大肠内肠道微生物群参与膳食纤维诱导IgA+ B220+细胞的可能性。
图1.膳食纤维增加小鼠LILP的IgA + B220 +细胞数量
（A）NFD喂养小鼠（左）与ND喂养小鼠（右）的LILP中IgA +细胞的流式细胞分析。（B和C）在NFD和ND喂养小鼠的LILP中，IgA + B220 +细胞（B）和IgA + B220–细胞（C）的频率。（D）NFD和ND喂养小鼠的SILP中IgA + B220 +细胞的频率。（E到G）NFD和ND喂养小鼠的PP（E），MLN（F）和脾脏（G）中IgA + B220 +细胞的频率。
2可溶性膳食纤维促进肠道产生IgA，并减轻DSS诱导的结肠炎
接下来，研究哪种类型的膳食纤维（可溶，不溶或两者兼有）影响LILP中肠道IgA产生。给野生型小鼠喂食含有10％菊粉的sHFD，含有10％纤维素的iHFD，NFD或ND 3周，然后测量LILP中IgA + B220 +细胞的频率。在sHFD喂养的小鼠LILP中，IgA + B220 +细胞频率高于iHFD和NFD喂养的小鼠（图2A）。此外，sHFD喂养小鼠分离的肠内容物中IgA含量要明显高于iHFD，NFD和ND喂养小鼠（图2B）。激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）为从IgM到IgA的免疫球蛋白的类别转换重组（CSR）和体细胞超突变（SHM）所必需。AID是在肠道中产生IgA的关键基因。缺乏AID的小鼠会因缺乏IgA而引起微生物群破坏。因此，调查sHFD和NFD喂养小鼠LILP中的AID表达是否参与IgA诱导。结果发现与NFD喂养小鼠相比，sHFD喂养小鼠的LILP B细胞中AID表达显著增加（图2C）。因此，可溶性膳食纤维与LILP中肠道IgA和AID表达的增加有关。接下来，用DSS诱导结肠炎，检查摄入sHFD升高小鼠IgA水平和AID表达的生理相关性。发现NFD和sHFD喂养小鼠之间体重减轻（图2D）和结肠长度（图2E）存在显著差异。NFD喂养小鼠比sHFD喂养小鼠对DSS诱导的结肠炎更敏感。
图2.sHFD增加LILP中IgA产生和AID基因表达水平，sHFD摄入可减轻DSS诱发的结肠炎
（A）NFD，iHFD，sHFD和ND喂养小鼠的LILP中IgA + B220 +细胞的频率。（B）ELISA测量NFD，iHFD，sHFD和ND喂养小鼠肠内容物中IgA的水平。（C）NFD和sHFD喂养小鼠的LILP B细胞中的AID表达。（D和E）给8周龄的野生型小鼠饲喂NFD或sHFD 3周。然后将2.5％的DSS口服给予NFD和sHFD喂养的小鼠5天，在接下来的3天中将DSS换成饮用水。每天测量体重（D），并在第8天测量结肠长度（E）。
3 膳食纤维会改变拟杆菌属的组成
我们和其他研究小组表明，sHFD喂养的小鼠中拟杆菌与其他门的比例高于NFD喂养的小鼠。因此，拟杆菌可能是肠道IgA诱导中涉及的主要门。假设拟杆菌属物种被sHFD诱导并参与肠道IgA诱导。为了确定sHFD增加拟杆菌属中所包括的细菌种类，在饲喂3周不同纤维饮食（sHFD，iHFD，NFD和ND）的小鼠中对大肠肠道内容物进行基于hsp60的特征分析。在所有读取中，拟杆菌的丰度比率为21.2％（范围为4.8％至48.4％）。使用红-黄-绿梯度可视化相对丰度的Log10量表，其中红色代表167种拟杆菌属物种的丰富度比率，最高分（0），绿色代表最低分（≤-5）（图3）。根据基于hsp60的种属细菌门类中物种分布的分布图，在ND喂养的小鼠中，主要的拟杆菌属是Parabacteroides distasonis（平均相对丰度，0.1502±0.1660）和Bacteroidesacidifaciens（0.0523±0.0576），其次是Parabacteroidesmerdae（0.0487±0.0491），Bacteroidesxylanisolvens（0.0429±0.0682）和Bacteroides sartorii（0.0114±0.0100）（图3A）。
比较两组sHFD和ND喂养小鼠拟杆菌门的种类组成发现，sHFD喂养小鼠中8种拟杆菌门的相对丰度显著增加(B. massiliensis、B. vulgatus、B. sartorii、B. acidifaciens、B. caccae、B. faecis、B. rodentium、B. uniformis) (P < 0.05)。B. acidifaciens是sHFD喂养小鼠的主要种类(平均丰度, 0.2729 ± 0.1523)，其次是B. sartorii (0.1529 ± 0.0607), B. vulgatus (0.1018 ± 0.1266), B. massiliensis (0.0675 ± 0.0347), 和 B. uniformis (0.0280 ± 0.0289)。
与ND饲喂的小鼠相比，NFD饲喂的小鼠中的B. massiliensis，B. vulgatus和B. sartorii的相对丰度显着增加（P <0.05）。B. sartorii 是NFD喂养小鼠中的主要物种（平均相对丰度，0.1991±0.0555），其次是B. vulgatus（0.1206±0.0864），Massiliensis（0.0873±0.0255）和B. acidifaciens（0.0598±0.0277）。在iHFD喂养的小鼠中，与ND喂养的小鼠相比，仅B. vulgatus的相对丰度显着增加（P <0.05）。在以iHFD喂养的小鼠中，Parabacteroidesmerdae是主要的物种（平均相对丰度，0.1600±0.1395），其次是B. acidifaciens（0.0428±0.0283），约Parabacteroides johnsonii（0.0426±0.0375）和B. vulgatus（0.0173±0.0049）。
4 从NFD到sHFD的转换增加小鼠肠道中B. acidifaciens物质的相对丰度
为了确认B. acidifaciens的诱导是否实际上取决于可溶性纤维饮食，在前两周给小鼠喂食sHFD或NFD，然后在接下来的两周改用另一种饮食。B. acidifaciens在NFD→sHFD喂养的小鼠中增加（平均相对丰度，0.8273±0.0198; P = 0.0128），但在sHFD→NFD喂养的小鼠中减少（平均相对丰度，0.1761±±0.1240）（图3B）。这些结果表明，如果改变饮食中的纤维类型，肠道菌群的组成会迅速变化，而B. acidifaciens的诱导取决于sHFD的摄入。使用流式细胞术检测LILP中IgA + B220 +细胞，观察到sHFD→NFD喂养小鼠LILP中IgA + B220 +细胞的频率明显低于NFD→sHFD喂养的小鼠（图3C）。在NFD→sHFD喂养的小鼠中分离出的肠内容物中IgA含量比sHFD→NFD喂养小鼠高得多（图3D）。接下来，检查LILP B细胞的AID表达。与sHFD→NFD喂养的小鼠相比，NFD→sHFD喂养小鼠AID表达增加（图3E）。
5 鉴定与鼠肠中IgA诱导相关的拟杆菌属物种。
为了确定与膳食纤维诱导的肠道IgA相关的拟杆菌属物种，我们检查了如图2B所示的肠道IgA水平与NFD，sHFD，iHFD和ND喂养的小鼠中拟杆菌属的相对丰度之间的相关系数。如图3A和表S1所示，初步鉴定出8种拟杆菌门(B. faecis, B. caccae, B. acidifaciens,B. uniformis, B. rodentium, Alistipes shahii, Bacteroides finegoldii,Bacteroides plebeius)与肠道IgA水平相关(表1)。根据基于假发现率的结果，B. faecis, B.caccae,和B. acidifaciens与肠道IgA水平显著相关（q值分别为0.001428、0.002857和0.004285）。从系统上讲，它们属于B. fragilis组(图3A)。在3个物种中（B. faecis, B. caccae,和B. acidifaciens），B. faecis与IgA水平的相关性最为显著，其次是B. caccae,和B. acidifaciens。在sHFD喂养的小鼠中， B. vulgatus, B.massiliensis, 和 B. sartorii相对丰度增加但与肠道IgA水平没有相关性。因此，在小鼠肠道菌群中，B. faecis, B. caccae,和B. acidifaciens的相对丰度表现出与肠道IgA水平具有一定相关性。
图3.膳食纤维会改变肠道细菌的组成
基于hsp60的分析，（A和B）热图显示167种拟杆菌和拟杆菌亚组的相对丰度，包括在NFD，iHFD，sHFD和ND喂养小鼠的肠道内容物中鉴定的普氏菌属和卟啉单胞菌属（A）和sHFD→NFD喂养的小鼠和NFD→sHFD喂养的小鼠（B）。（C）sHFD→NFD喂养和NFD→sHFD喂养的小鼠LILP中IgA + B220 +细胞的频率。（D）通过ELISA检测sHFD→NFD喂养小鼠和NFD→sHFD喂养小鼠的肠内容物中IgA的水平。（E）在sHFD→NFD喂养和NFD→sHFD喂养的小鼠中LILP B细胞中的AID表达。
6 B. acidifaciens 单独定殖的小鼠IgA水平升高
基于这些结果，我们分析脆弱拟杆菌属在肠道IgA诱导中的功能。我们专注于B. acidifaciens，其是B. fragilis组中的主要物种。为了研究B. acidifaciens是否增加肠道IgA产生，应用无菌小鼠。使用B. vulgatus作为B. acidifaciens的对照组，这两个物种在系统发育上不同，并且sHFD喂养和NFD喂养的小鼠中它们的比率相反（图3A和B）。单独定殖的小鼠在生物隔离器中喂食正常饮食(CMF) 3周。B. acidifaciens定殖小鼠粪便菌群含量10.7 ~ 10.8 CFU/g(log10)， B. vulgatus定殖小鼠粪便有10.83 ~ 11.09 CFU/g(log10)。表明这两种菌的定植水平相同。检测B. acidifaciens和B. vulgatus定殖小鼠大肠LILP中IgA +细胞，检测肠内容物中IgA。采用流式细胞仪检测LILP中IgA+ B220+细胞和IgA+ B220 -细胞(图4A)。B. acidifaciens定殖小鼠LILP中，IgA + B220 +细胞的频率高于B. vulgatus定殖小鼠（图4B），而IgA + B220-细胞的频率没有差异（图4C）。另外，B. acidifaciens定殖小鼠肠内容物中IgA高于B.vulgatus定殖小鼠（图4D）。B. acidifaciens定殖小鼠LILP B细胞中ADI表达也高于B.vulgatus定殖小鼠（图4E）。B. acidifaciens单独定殖小鼠后在增加IgA分泌和上调AID表达方面可能比B.vulgatus具有更高的潜在作用。总的来说，我们发现肠道IgA，B. acidifaciens和AID表达之间可能存在因果关系。
肠道微生物群产生的代谢物以各种方式参与免疫反应的调节。因此，我们分析B. acidifaciens在体内产生的代谢物，这些代谢物可能对增加IgA和上调肠道内的AID表达有作用。为了研究B. acidifaciens定殖小鼠中哪些代谢产物增加，对B. acidifaciens和B.vulgatus定殖小鼠的大肠内容物进行代谢组分析。B. acidifaciens和B.vulgatus的分层聚类分析（HCA）结果显示出不同的特征。两种菌定殖的小鼠的主成分分析（PCA）结果也不同。PC1的因子负荷分析显示，在212个代谢物中，B. acidifaciens比B.vulgatus定殖小鼠的代谢物含量高。代谢物可能为解决肠道IgA诱导的机制提供可能性。
图4.与B. vulgatus定殖小鼠相比，B. acidifaciens定殖小鼠的IgA水平和AID表达升高
（A）流式细胞分析B. acidifaciens与B. vulgatus定殖小鼠LILP中IgA + B220 +和IgA + B220-细胞。（B和C）在B. acidifaciens与B. vulgatus定殖小鼠的LILP中，IgA + B220 +（B）和IgA + B220-（C）细胞的频率。（D）ELISA测量B. acidifaciens与B. vulgatus定殖小鼠的肠内容物中IgA水平。（E）在B. acidifaciens与B. vulgatus定殖小鼠LILP B细胞中AID的表达。
7 讨论
饮食和微生物群与宿主免疫系统密切相关。先前的报告表明，拟杆菌的水平与长期摄入纤维正相关。这项研究报道可溶性高纤维饮食增加脆弱拟杆菌属的比例，增加肠道中IgA产生和AID的表达。先前的研究表明，IgA的产生受细菌门类的影响。但是，尚不了解拟杆菌属的物种水平所产生的影响。先前证明，sHFD喂养的小鼠中拟杆菌的比率高于NFD喂养的小鼠。因此，本研究使用基于hsp60的谱分析方法展示拟杆菌门的物种谱，分析拟杆菌门中不同物种的丰度。结果表明可溶性高纤维饮食增加脆弱类杆菌属的某些特定物种如B. acidifaciens的比例，以及诱导IgA和AID的产生。研究B. acidifaciens和IgA / AID诱导是否相关。主要应用B. acidifaciens单独定殖的无菌小鼠，结果显示该菌参与IgA产生和AID表达（图4）。
这项研究报道了在sHFD和ND喂养的小鼠中，LILP中IgA + B220 +细胞的频率选择性升高，而在iHFD和NFD喂养的小鼠中，IgA + B220 +细胞的频率降低（图1B和2A），表明肠道菌群影响IgA + B220 +细胞的频率。与这一结果相一致的是，IgA+ B220+在B. acidifaciens定殖小鼠中的数量高于B.vulgatus定殖小鼠，而IgA+ B220 -的数量没有差异(图4B和C)。先前的研究表明，B. acidifaciens与IgA诱导有关。根据先前的研究，IgA + B220 +细胞是由IgM + B220 +细胞产生的，并且刚刚完成CSR，而IgA + B220-细胞已经完成CSR。因此，有研究表明，sHFD喂养的小鼠和B.vulgatus定殖小鼠LILP中IgA+ B220+细胞的增加刚刚完成CSR，有助于肠道产生IgA。在LILP B细胞中，AID是诱导IgM向IgA转变的关键基因。这项研究中表明，在sHFD喂养，NFD→sHFD喂养以及B. acidifaciens定殖的小鼠中，LILP B细胞中的AID表达增加（图2C，3E和4E）。AID表达的上调与肠道IgA水平的增加相关（图2、3和4）。确实，先前的研究表明，AID缺陷型小鼠无法产生IgA + B220 +细胞。因此，B. acidifaciens对AID表达的上调可能有助于ILP中IgA + B220 +细胞群的产生。
据报道，高纤维饮食和高脂饮食等饮食会影响胃肠道免疫反应。这项研究将菊粉用作可溶性高纤维饮食，纤维素用作不溶性高纤维饮食。尽管使用这些饮食推广可溶性或不溶性纤维的效果可能有一定的局限性，但肠道菌群的组成却发生变化。值得注意的是，我通过基于hsp60的分析方法显示拟杆菌属物种分布的变化。肠道内容物中的微生物群迅速改变。先前的研究表明，短期食用动物性或植物性饮食会改变人体的微生物结构。通过从NFD摄入到sHFD摄入的饮食变化，可以在2周内改变脆弱拟杆菌组成员的比例，例如B. acidifaciens，IgA诱导和AID基因表达（图3B至D）。另一方面，饮食从sHFD到NFD摄入的变化会降低脆弱拟杆菌组成员的比例，IgA产生和AID基因表达（图3B至D）。
研究表明，B. acidifaciens是小鼠肠道菌群中最主要的拟杆菌门，参与小鼠肠道中IgA的产生。其他拟杆菌属物种，例如 B. faecis 和 B. caccae，可能与IgA产生有关，因为这两个物种与IgA水平也具有显着的相关系数（表1）。另一方面，B. vulgatus与IgA的产生无关。而且，iHFD诱导的副拟杆菌物种，例如 P. johnsonii 和 P. merdae与IgA的产生无关。
人类中尚未发现B. acidifaciens。B. acidifaciens相当于脆弱拟杆菌群，被认为是与人类Bacteroides ovatus和 Bacteroidesthetaiotaomicron密切相关的物种。越来越多的证据表明，肠道菌群与代谢性疾病和炎性疾病有关。最近的研究表明，Bacteroides ovatus和 Bacteroidesthetaiotaomicron都参与免疫反应。此外，先前的一项研究也报道B. acidifaciens有助于提高小鼠的胰岛素敏感性，抑制肥胖和2型糖尿病。基于这些观察结果，脆弱拟杆菌，包括B. acidifaciens，介导免疫系统并影响健康和疾病。我们的结果表明，摄入NFD对DSS诱发的结肠炎趋于敏感（图2D和E），表明可溶性纤维饮食可能具有减轻溃疡性结肠炎的潜在作用。
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