科研 | 高静水压（HP）下低TCA循环速率阻碍了烃的降解，并使深海微生物群落降解石油成为可能！
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石油烃化合物在自然和人为因素之后抵达深海。其进入深海微生物食物网并影响碳和其他元素的生物地球化学循环的过程尚不清楚。静水压力（HP）是深海的一个独特参数，却很少被研究。HP是否仅影响石油降解群落的装配和活动仍有待解决。在这里，深海微生物群落中的碳氢化合物降解效率在天然HP（10MPa，海平面以下约1000m）低。在长期过程中，增加的HP选择性地抑制专性碳氢化合物降解并下调β氧化相关蛋白（即主要的碳氢化合物降解途径）的表达，导致低效率细胞生长和CO2产生。使用HP适应性群落的短期实验证实了这一数据，揭示了HP依赖柠檬酸盐和二羟基丙酮的积累。柠檬酸盐积累表明TCA循环中脂肪酸的有氧氧化速率降低。二羟基丙酮通过甘油代谢和糖酵解与柠檬酸盐连接，两者都被增加的HP所上调。因此，专性烃降解物的高降解速率可能对增加的HP不利，这解释了它们的选择性抑制。通过实验室规模的培养，本研究首次突出了高HP下碳氢化合物降解过程中受损细胞代谢与微生物群落组装之间的联系。总体而言，该数据表明，与深海环境相比，地表水中的碳氢化合物降解差别很大，低温和有限的养分供应有望进一步延长深海碳氢化合物的持久性。
论文ID
原名：Reduced TCA cycle rates at high hydrostatic pressure hinder hydrocarbon degradation and obligate oil degraders in natural, deep-sea microbial communities
译名：深海微生物群落在高静水压（HP）下的低TCA循环速率阻碍了可能对石油碳氢化合物的降解
期刊：The ISME Journal
IF：9.520
发表时间：2018年11月
通信作者：Alberto Scoma，Frederiek-Maarten Kerckhof，Angeliki Marietou，Thomas Vosegaard 和Ibrahim M. Banat
通信作者单位：Gent University of Belgium，Aarhus University of Denmark，Aarhus University of Denmark 和University of Ulster , UK
实验设计
图 1
实验内容
1 高HP选择具有高营养摄取，但生物量低和烃降解能力低的小型培养物
为了评估微生物的石油降解能力，将测试反应器的pH与双阴性对照进行比较，一个没有添加碳，另一个没有海洋沉积物（图2）。如果C20或C30作为唯一碳源供应，则降低的pH值表明高烃降解活性，因为水中的CO2电离产生HCO3-和H+。在整个富集过程中，所有测试反应器显示相对于阴性对照的较低pH（p <0.05，图2）。在三次重复接种（即30天）后，海洋沉积物从所有反应器中完全洗掉，因此除去附着在沉积物上的微生物的潜在可能性。在没有C20或C30的对照中，这导致可忽略的细胞计数（通过流式细胞术评估;这些对照在50天后停止）。与0.1MPa的两种对照培养物相比，HP反应器显示出较低的酸化能力（图2）。这在用C30富集时特别明显，因为在增加的HP培养70天后显示出酸化损失能力并且在任何新的批次孵育时都不能将pH降低至低于约7.15（图2）。这没有反映在任何其他生理测量中，因为富集培养物在30至90天之间是可比较的（图3）。与具有碳源的环境对照相比，高HP的培养物通常具有较低的细胞数（图3a，b），并且特征在于尺寸越来越小（通过流式细胞术在1.5μm过滤的样品上评估，图3c，d）。小型细胞不仅仅是由于高HP施加的物理限制（如果有的话），因为细胞计数在减压后1-2小时进行。无论应用何种HP，供应C20的培养物的pH值都低于C30的pH值，而后者具有更高的细胞数。
HP没有显着改变任何碳源的每个细胞的O2呼吸（p> 0.05，图3e，f）。尽管如此，高HP刺激每个细胞减少SO42-，这比有氧对照更高，并且通常与微需氧对照相当（p <0.05;图3g，h）。这必须考虑到高HP反应器中细胞呼出的O2总量高于微需氧对照。最后，与环境压力下的两个对照相比，每个细胞的碳源高HP增强PO43-消耗（p <0.05;图3i，j）。
图2：在不同HP（0.1,10和20MPa）下作为唯一碳源的C20a 或C30 b 供应的富集聚生体的pH降低和0.1MPa的双阴性对照中的pH降低。在需氧（+ O2）或微需氧（-O2）条件下测试浓度为0.1MPa的聚生体。每个数据点代表10天的孵育期，之后将培养物稀释10％（v：v）并再次孵育10天。
图3：a-d，O2呼吸。e，f，营养物消耗。g-j，在不同HP（0.1,10和20MPa）下C20或C30作为唯一碳源的富集聚生体中的最终细胞数。在需氧（+ O2，绿色）或微需氧（-O2，黄色）条件下测试浓度为0.1MPa的聚生体。
2 高HP抑制特殊的碳氢化合物细菌，并选择通用的非特异性石油降解菌
向原始沉积物供应长链烃导致显着的微生物演替（图4a）。在环境对照中，对于增加的HP与烃的共同响应是除硫单胞菌科（Desulfuromonadaceae）的显着丰度（p <0.05，图4a）。在高HP下，C20的供应也显着富集了盐单胞菌科（Halomonadaceae），木栓菌科（Pseudoalteromonadaceae）和希瓦氏菌属（Shewanellaceae），C30显着更富含弧菌科（Vibrionaceae）。一些所谓的专性碳氢化合物细菌（OHCB），一组几乎完全在石油上生长的海洋微生物，存在于我们的富集物（例如，深海弯曲菌（Thalassolituus）和食烷菌（Alcanivorax））中。虽然在环境压力下两种对照物都占主导地位，但OHCB几乎完全受到高HP的抑制（图4b）。
图4：用作接种物的无烃海洋沉积物中的细菌家族的相对16S rRNA丰度（原始HP≈10MPa）和富集的聚生体，以及在C20（左）或C20提供的检测到的富集聚集体 B：OHCB属通过Illumina测序评估，C30（右）作为不同HP（0.1,10和20MPa）的唯一碳源。在需氧（+O2）或微需氧（-O2）条件下测试浓度为0.1MPa的聚生体。
3.高HP可以下调β-氧化并增加持家蛋白
如通过蛋白质组分析所描述的，高HP富集的聚集体（90天）中的形成细胞代谢，特别是关于持家蛋白功能。与环境对照相比，高生理功能相关的蛋白质如ATP合成，离子和质子转运的表达上调，而转录被下调（p <0.05，图5）。离子和质子传递的重要性增加可能与烃氧化后的酸化有关，因为与大气压相比，由于增加的CO2溶解度，高HP的细胞可能经历较低的pH值。在低丰度蛋白质中，高HP负面影响脂质降解，脂肪酸和脂质代谢。特别是与高碳值的碳源相比，与脂肪酸β-氧化相关的蛋白显着下调。映射的蛋白包括自由基O2解毒的酶，暗示在高HP下的活性烃氧化和环境压力下的需氧控制。然而，在高HP下的O2应力等于或低于在环境压力下的好氧对照中的O2应力，表明HP增加的增强的溶解O2水平不会变成培养物的应激因子。尽管如此，在高HP浓缩物中用于亚硫酸盐还原的几种蛋白质证实了O2吸入之后是厌氧生物和碳源的SO42-还原（图3g，h）。最后，虽然鉴定了用于烷烃降解的蛋白质，但是在环境压力下仅在需氧对照中用C30检测到负责末端氧化的烷烃1-单加氧酶。
图5：富含在C20（左）或C30（右）与在不同HPs（0.1，10和20 MPa）的唯一碳源的聚集体中的生物功能相关高丰度蛋白的热图（上图）和低丰度蛋白的雷达分布（下图）。在需氧（+ O2）或微需氧（-O2）条件下测试浓度为0.1MPa的聚生体。热图箱（顶部）和雷达图（底部）中报告的数字表示相对于所有检测到的蛋白的生物功能表达的蛋白质的百分比。
4.高HP适应的群落证实了向低烃降解能力的通用非特异性石油降解菌的转变
来自富含10MPa和20MPa的C20聚生体的多物种菌落用作接种物以组装高HP适应性群落（HHPSC），其在0.1和10MPa下使用C20或乙酸盐作为对照的唯一碳源进行测试（图1）.HHP-SCs在酸化能力和生长方面的性能与在等效增加的HPs下选择的富集的聚生体相当（即10MPa; p> 0.05，图6a，b）。因此，即使在没有分离的δ-变形菌纲的情况下，HHP-SC也可再现了HP富集的烃降解能力。此外，当在环境压力下测试这样的HHP-SC时，与在0.1MPa下长期实验富集的聚生体相比，它们的性能较低（p <0.05，图6a，b），其主要由深海弯曲菌控制。无论供应的碳源如何，HP增加的HHP-SC的细胞生长均增加（图6c），导致总二氧化碳产量低，尽管HHP-SCs微生物群落组成没有因应用的不同条件而显着改变。尽管在非无菌条件下进行测试，但HHP-SC仅由8个主要OTU（总16S rRNA序列的99.0-99.4％，图7）代表，所有这些最初都存在于用作接种物的多种菌落中。特别是，HHP-SC由四个OTU的核心群体构成，其代表性最高，特别是在测试条件下（即10MPa，C20; 96.4％，图7）。这种核心共性由四种通用的，非特异性的石油降解属弧菌属，深海弯曲菌，盐单胞菌和木栓菌构成，发现它们经常在多种菌落中。T. oleiovorans（OTU00005）在环境压力下在C20存在下生长，但在10MPa（16S rRNA丰度从10.7到1.5％，log2 fc-2.8;图7）中被抑制，如在富集中发生的那样（图4b）。
图6：HHP-SCs的生理反应与长期富集相比，当它们在0.1和10MPa下供应C20作为唯一的碳源时，以及在以0.1和10MPa供应C20或乙酸盐作为唯一碳源时，HHPSC的生理反应
图7：基于16S rRNA的高流体静压适应群落组合和每个检测到的OTU的蛋白质表达水平
5.高HP导致细胞内柠檬酸盐和二羟基丙酮积累
高HP导致细胞内柠檬酸盐积累，并分析了细胞代谢。除了负责末端氧化的烷烃1-单加氧酶，可以重建与烷烃活化和β-氧化相关的完整的蛋白质组。与高HP相比，在环境压力下HHPSC不能恢复β-氧化相关蛋白的高表达水平，也没有恢复与脂质和脂肪酸代谢或脂质降解相关的蛋白的高表达水平。然而，高HP上调甘油代谢。甘油可能用于生产生物表面活性剂。然而，可以重建将甘油代谢连接到三羧酸循环（TCA）的整个蛋白质组（图8a）。通过少量酶促反应相互连接的这些途径的两个关键中间体，即柠檬酸盐和二羟基丙酮，在高HP的细胞中显着积累（图8b），在二羟基丙酮积累中，水和脂溶性细胞内代谢物的一般HP依赖性重建（p <0.05;图8c，）。
图8：a：供应C20的HHP-SC中涉及甘油代谢的映射的蛋白质代谢相关的TCA循环。b：从水相中选择细胞内代谢物。c：在0.1和10MPa下，以C20或乙酸盐作为唯一碳源提供，在来自HHP-SC的细胞中的细胞内代谢物谱。
结 论
本数据报告了第一份综合概述，描述了HP如何塑造微生物碳氢化合物降解的生理学和生态学。进行脂肪酸氧化的最终步骤的能力降低将降低β-氧化水平，导致低细胞生长和烃矿化。因此，在高HP下可以防止OHCB维持高烃降解速率的选择性优势，从而允许通用的非特异性石油降解物种茁壮成长。实际上，尽管电子受体可用，但在高HP反应器中发生的烃氧化减少，增强的HP需要更高的维持细胞的稳态，其涉及细胞膜组成。应进一步研究TCA循环，ATP合成，pH稳态和深海HP的烃氧化之间的相互作用。这与评估人为泄漏后进入深海的碳氢化合物相关，因为低温和缺乏营养物质会进一步降低碳氢化合物降解物种。
评 论
在实验室规模的实验中使用增加的HP是一种研究深海石油降解的新兴方法。尽管使用反应堆可能会将微生物多样性减少到可培养物种，但就HP而言，它可以模拟一个难以进入的环境，例如深海。现有文献表明增强的HP影响细菌碳氢化合物的消耗，但它没有解释HP，微生物群落和碳氢化合物降解能力之间的关系。在本研究中，使用原生适应10 MPa的原始海洋沉积物微生物群落来破译HP对微生物碳氢化合物代谢的唯一影响，而不依赖于沿水柱可能不同的其他参数。
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