细胞株转染方法介绍

通常使用的转染方法主要有DNA-磷酸钙共沉淀法，电击法，脂质体法。

质粒DNA的基本元件

外源基因是以质粒DNA的形式进入动物细胞的，同时质粒DNA上带有提高外源基因转录和翻译水平的元件。尽管病毒来源的载体和细菌来源的载体都被用来将外源基因导入动物细胞，但是工业上在构建细胞株的过程中极少用到病毒来源的载体。

目的基因可以由组成型，诱导型或条件型启动子进行启动转录。在细胞分化和发育的研究中经常用到条件型启动子，它可以由某些特定因素引发，导致蛋白表达，影响细胞的分化。但是在重组蛋白的生产中，绝大多数表达载体使用强组成型的的启动子。通常病毒来源的启动子，如SV40晚期启动子和CMV启动子，应用最为广泛。近年来，CHO来源的EF-1和GAPDH的启动子也被应用到蛋白生产中。

为了提高转录水平，除了使用强的启动子外，还可以在目的基因中插入内含子。通常可以看到在目的蛋白的基因中含有至少一个内含子。此外，密码子优化可以提高基因的翻译水平。表达载体除了包含启动子、增强子和目的基因外，还需要有筛选标记基因，甚至，扩增标记基因。

尽管转染后有大量的质粒进入细胞，但是只有极少数能够进入细胞核，进一步整合到基因组中。细胞中只有整合的质粒才能复制，未整合的质粒逐渐被降级或丢失。转染后至少有一个筛选标记基因（抗性基因）整合到基因组并成功表达的细胞在抗性的压力下才能存活。

筛选标记可以分为显性的和隐形的。隐形筛选标记是细胞内固有的基因，缺失时影响细胞生长（如DHFR）。通过引入外源补偿基因可以克服这类缺陷。比如，CHO DG44 细胞是DHFR基因双敲除的细胞株，需要在培养基中添加HT才能正常生长。通过转染使其获得功能性的DHFR基因，就能使它在不含HT的培养基中也能生长。相反，显性筛选标记（一般为抗生素）对细胞具有杀伤作用。通过向细胞中引入抗性基因可以赋予细胞对抗显性筛选标记的能力。每一个抗性基因编码一种酶，可以破坏显性筛选标记的化学结构。下表（table2）中显示的是常用的显性筛选标记和抗性基因等信息。

参与使抗生素失活的酶（由抗性基因表达）只有在细胞内才有活性，失活过程中的磷酸化和乙酰化反应需要ATP和乙酰基团等底物，因此抗生素的失活必须在细胞内部才能进行。另一方面，蛋白酶即使在细胞死后释放到培养基中仍有活性。因此，在细胞株筛选过程中，筛选试剂（如抗生素）的浓度随时间逐渐降低，降低的速率取决于转染后细胞的密度。所以，最优的筛选试剂浓度不止取决于细胞系，也取决于细胞的密度。单克隆筛选和细胞群体“Pool”筛选在抗性浓度的使用上可能大不相同。