实时荧光定量PCR实验技术原理

实时荧光定量PCR实验原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性、低温复性、适温延伸的热循环，并遵循聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在指定光激发下发出荧光；当循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值（Cycle threshold，循环阈值，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数），同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

实时荧光定量PCR主要事项：1.控制加量误差：使用加样器时，应定期进行校准，避免反复调档，以减少系统误差，加量的准确。若需调档，应顺时针缓慢调动；对常用量应设专档专用。
2.标本处理：标本的处理对FQ—PCR测定核酸模板的成功提取具有决定性作用。此过程主要为手工，在操作中要格外小心，严防交叉污染，避免吸入杂质，特别是每类标本都有各自标准化的处理程序，应严格遵循每个步骤的要求。另外，一次性用品的选择很重要，如离心管、吸头的质量要严格要求，严格**，避免杂质及其它病原微生物成为扩增的对象而造成结果的偏差。
3.标本的适当保存：标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。标本采集后应立即送检，不同标本的保存方法各异。若不能及时检测通常在-20至-70℃的条件下保存，避免反复冻融（若冻融1次病原数量明显减少从而影响测定结果的准确性下降）。