【LorMe周刊】不进则退：波动环境下两物种相互作用的命运
作者：尹悦，南京农业大学博士在读，主要研究根际微生物互作。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍微生物相互作用在恒定及波动环境下的长期稳定性。原文于2020年发表在《The ISME Journal》上。
物种间的正相互作用是生态系统运作的基础，考虑到它的重要性，了解其在恒定及波动变化的环境条件下在进化尺度上的稳定性是至关重要的。作者构建了由两个物种组成的微生物系统来研究这个问题，在这个系统中通过营养供给来调节二者之间的互作。作者分别将两个微生物在恒定或波动变化的环境中单独进化或共进化200代，设置四个重复，并测定进化实验过程中在不同时间点分离得到的单克隆的全基因组序列。结果发现，在恒定环境中两个微生物共存了200代；相反，在波动变化的环境中，其中一个微生物在两个重复中灭绝了。作者还证实了这些动态是由一小段基因的自适应突变驱动的。总之，在波动变化的环境中，快速进化破坏了两两物种间的正相互作用的长期稳定性。
在这个研究中，作者构建了由两个物种组成的系统，分别是约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii C6）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida KT2440）。当它们生长以柠檬酸为唯一碳源的环境中时，它们之间是竞争关系；而当它们生长在以苯甲醇为唯一碳源的环境中时，恶臭假单孢菌就会以约翰逊不动杆菌分泌的苯甲酸为食，是一种交叉喂养的互作关系。
进化实验设置三个处理：（1）恒定的苯甲醇环境；（2）恒定的柠檬酸环境；（3）每天在柠檬酸和苯甲醇之间切换，模拟波动变化的环境（图1）。分别将单菌和共培养物在这三个环境开展进化实验，每个处理设置四个重复，进行每日转接，整个进化实验持续一个月（约200代）。
图1 实验设计
主要结果
一、恒定环境中物种可以长期稳定共存，在波动变化的环境中则不稳定
在恒定的柠檬酸条件下，恶臭假单胞菌驱使约翰逊不动杆菌在一周后灭绝（图2A）。相反，在恒定的苯甲醇条件下，这两个物种共存了200代（图2B）。约翰逊不动杆菌在整个实验过程中都保持着较高物种密度，在第16天密度急速下降随后又恢复了。第30天，约翰逊不动杆菌的平均种群密度是4.0×107 ± 4.3×106 CFU/mL，共存的恶臭假单孢菌种群密度为2.7 × 105 CFU/mL ± 3.8 × 104 CFU/mL。共培养中恶臭假单孢菌的种群密度比单独培养中的种群密度高一个数量级，这表明约翰逊不动杆菌对恶臭假单孢菌的积极作用可以维持200代（图3）。因此，恒定环境下交叉喂养的相互作用在进化的时间尺度上是稳定的。
在恒定的环境条件下，四个重复群落都得到了相同的结果。相反，在波动变化的环境中，四个群落则出现了两种不同的结果，群落1和2中约翰逊不动杆菌在第18、19天灭绝，群落3和4中约翰逊不动杆菌和恶臭假单孢菌却能一直稳定共存（图2C）。为了评估碳源的波动是否会导致约翰逊不动杆菌的灭绝，作者设置了约翰逊不动杆菌单独在波动环境中的进化，最终发现，约翰逊不动杆菌在整个实验过程中均能稳定存在（图4），这表明在波动环境中是由于约翰逊不动杆菌和恶臭假单孢菌的互作最终导致了约翰逊不动杆菌的灭绝。
图2 两物种群落在三个环境中表现出不同的生态进化动力学
图3 约翰逊不动杆菌在恒定的苯甲醇环境中对恶臭假单胞菌的积极影响在进化过程中得以维持
图4 三种不同的环境下单独培养的菌株在整个进化实验中都会持续存在
二、灭绝不是随机事件而是快速进化的确定性结果
作者从一个中间时间点重新开展了进化实验，并量化了约翰逊不动杆菌灭绝的频率。从保存的第14天（约92代）的四个群落样本中分离得到各个种群，每个种群挑选6个菌株，并在波动的环境中将种群转接了6天。在群落1的六个重复样本中，约翰逊不动杆菌在6天后接近灭绝（图5）。对于群落2，六个重复中有五个约翰逊不动杆菌在5天后灭绝。而在群落3和群落4中，约翰逊不动杆菌维持中等种群密度，最终种群密度分别约为6.1×104 CFU/mL ± 2.2×104 CFU/mL和4.1×105 CFU/mL ± 2.3×105 CFU/mL。总之，当从一个中间点重新开展进化实验时，约翰逊不动杆菌依然在群落1和群落2中灭绝，而在群落3和4中没有灭绝，这与最初的进化实验结果是一致的。因此，在本实验环境中，灭绝是确定性的结果。
图5当从一个中间点重新开始进化实验，共存和灭绝的结果是可重现的
三、物种在转接200代之后表现出了适应性进化
作者测定了从第200代分离的单菌的基因组，并分析确定了相对于其祖先基因组的“新生突变”。结果发现，200代后平均每个单菌都积累了两个突变。平均每个单菌发生1.3个点突变，0.5个短插入和缺失，以及0.2个大缺失（> 30 bp）。点突变显示出了很强的适应性进化信号，且大多数突变发生在开放阅读框中。对于恶臭假单孢菌，最常见的突变基因是gacS（表1），此外也发现了一些影响运动调节的突变。对于约翰逊不动杆菌，最普遍的突变基因是oatA。oatA基因编码O-乙酰基转移酶OatA。据报道，其他细菌物种的OatA可以修饰细菌细胞壁，从而阻止溶菌酶的抗菌活性等。考虑到同时在多个细菌中观察到这一目标基因（1926 bp）的突变，随机突变的可能性很低，则很有可能是一种适应性突变。
为了更好地理解这种假定适应性突变的优势，作者分析对比了突变菌株和祖先菌株在柠檬酸、苯甲醇条件下的生长情况。最终发现在恒定苯甲醇和柠檬酸条件下进化后的两个菌株相比于祖先菌株具有更高的生长速率和生物量（图6）。但在波动变化的环境中进化的约翰逊不动杆菌却没有在恒定环境中进化的菌株生长的好，甚至在某些情况下，其生长能力远低于祖先菌株（图6）。相反，恶臭假单胞菌不论是在恒定的柠檬酸还是在波动的环境中进化，生长均明显优于祖先菌株。其中一些进化的克隆只发生了一处突变（例如oatA或gacS基因，表1），因此，观察到的生长能力的提高可直接归因于此位点突变的影响。为了确认这些突变是否属于适应性进化，未来还需要将单个突变基因插入祖先菌株，并测量其适应性作用。
表1 在实验条件下观察到的基因突变
图6 进化后的菌株相比其祖先菌株在苯甲醇（BA）、苯甲酸盐（Ben）和柠檬酸（Citrate）条件下的生长情况
注：最大生长速率（µ）和生物量（Y）；单独培养（mono）和共培养（co）；恒定柠檬酸（cstCi）、恒定苯甲醇（cstBA）和波动环境（Flu）。
四、恶臭假单胞菌的早期适应影响了约翰逊不动杆菌的进化轨迹
菌株在恒定及波动变化的环境中经过200代进化后获得了适应性突变。基于这个快速进化的结果，作者提出假设：在波动的环境中是否早在中间点（92代）就发生突变，以及这种突变是否与约翰逊不动杆菌的灭绝或持续存在有关。
作者首先测定了（在约翰逊不动杆菌灭绝之前）在波动环境中进化的第92代群落中分离得到的单菌的基因组。结果发现，在所有的四个重复中恶臭假单孢菌均积累了一个或更多的突变。且这些突变和从200代分离的单菌靶向相同基因和功能。此外，进化92代的恶臭假单孢菌比祖先菌株生长的更好：最大生长速度和生物量平均是祖先菌株的1.9倍（苯甲醇）和1.8倍（柠檬酸）。对于约翰逊不动杆菌，从群落1和2中（其中约翰逊不动杆菌最终灭绝了）分离得到的第92代克隆没有发生突变且与祖先菌株具有相同的生长特性（图6）。相反，从群落3和4（其中约翰逊不动杆菌一直持续到进化实验结束）分离的约翰逊不动杆菌有一个或两个突变。这些突变针对的是编码糖转移酶EpsL的epsL基因和转录透明质酸合酶的hyaD基因，仅在波动变化的环境中共培养时才观察到。但是作者每个时间点只测序一个克隆，因此并不知道这些突变是否代表了整个种群。但在第92代和第200代观察到了完全相同的突变。如果这些突变在种群中的发生频率较低，则对同一突变进行两次随机采样的概率非常低（P = 0.01）。因此，这些突变很可能已经在种群中处于高频率，或者在200代之前已经达到高频率。有趣的是，当约翰逊不动杆菌在苯甲醇或柠檬酸上单独生长时，携带这些突变的克隆的生长能力并没有显著改善（图6）。尽管不知道它们特定的功能或表型效应，作者推测这些突变可能通过调节约翰逊不动杆菌与恶臭假单胞菌的相互作用而避免了约翰逊不动杆菌的灭绝。
在恒定的环境中，尽管物种通过适应而发生变化，但两个物种之间交叉喂养的相互作用在进化时间尺度上是稳定的。相反，在波动变化的环境中，交叉喂养互作定期切换为竞争互作，则二者的稳定共存有时则会发生崩塌。同时发现一个物种的早期适应会影响另一个物种的生存甚至使其灭绝，除非另一个物种发生进化以抵消这种影响。
论文信息
原名：Rapid evolution destabilizes species interactions in a fluctuating environment
译名：在波动的环境中快速进化破坏了物种间的相互作用
期刊：The ISME Journal
IF2020：9.18
发表时间：2020.10
通讯作者：Alejandra Rodríguez-Verdugo
通讯作者单位：苏黎世联邦理工学院环境科学系