数字PCR实操结果及体会
作者：浮星
第一代PCR技术是常规PCR技术，对目的基因扩增后进行凝胶电泳，将扩增条带与已知浓度的标准品比较，得到定性结果，但在产物分析时需要开盖操作，容易引起交叉污染，导致假阳性。第二代PCR技术是在PCR反应体系加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应进程，通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术。
数字PCR是第三代PCR技术，是一种采用微流控或微滴化的方法将稀释后的待测样品核酸溶液分散至微反应器或微滴中再在相同条件下进行单分子PCR，检测每一个微反应器或微滴中荧光信号通过直接计数或泊松分布修正得到原始浓度或含量的核酸分子绝对定量技术。目前大致可分为三类：微反应室/孔板数字PCR、大规模集成微流控芯片数字PCR、液滴数字PCR。
我所实操的是液滴数字PCR，它是将反应体系以极低的浓度包裹在油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行扩增后再进行逐一检测荧光信号。ddPCR包含扩增反应体系配制、液滴发生、PCR、液滴检测四个步骤。实操仪器为伯乐QX200ddPCR系统。
01
试验类型
试验类型上有三类绝对定量 ABS，稀有事件检测 RED，拷贝数变异 CNV。一般是绝对定量即可。拷贝数目变异，又称为拷贝数目多态，是一种大小介于1kb至3Mb的DNA片段的变异。在分析CNV时，拷贝数被定义为目的分子浓度与参考分子浓度的比值。如要检测拷贝数变异时，选中CNV，会要求输入Reference Copies,一般的输入2，代表二倍体。下方的背景颜色和前景颜色随便选择，以区分不同试验。
02
液滴检测
每个反应体系为40ul，包括20ul扩增体系和20ul油，生成20000个微滴。为保证浓度计算较准确，一般要分析12000-16000个液滴，其中包含阳性液滴和阴性液滴。本实操中分析了14971个液滴，其中阳性液滴有2666个（HEX通道）。
03
1D Amplitude FAM通道
在分析的14971个液滴中，FAM通道检测到荧光信号的液滴数目有5244个，在荧光信号强度-液滴数图上可以看到两群，上面一条蓝色带为阳性液滴群，下面一条黑色带为阴性液滴群。下图是频率-扩增信号强度图，左边尖峰代表阴性液滴，右边小山峰代表阳性液滴。
04
1D Amplitude HEX通道
同理，这是HEX通道上的两群。
05
2D Amplitude
同流式细胞术类似，纵轴为FAM通道荧光强度，横轴是HEX通道荧光强度。右上液滴群是FAM+HEX+，左上液滴群是FAM+HEX-，左下液滴群是FAM-HEX-，右下液滴群是FAM-HEX+。
06
浓度分析
在这幅图中显示1基因浓度为507copies/ul，10140copies/20ul well；2基因浓度为231copies/ul，4620copies/20ul well。粗体字显示的507、231为实际检测的浓度值，而10140和4620是20ul扩增体系里总的浓度计算值。这时，要计算原始浓度，还需要根据配制扩增反应体系时加入的模板体积量来换算，我在20ul扩增反应体系中加入的模板体积是1ul，所以1、2两个基因的原始浓度为10140/1=10140copies/ul、4620/1=4620copies/ul。如果在20ul扩增反应体系中加入的模板体积是5ul，则1、2两个基因的原始浓度为10140/5=2028copies/ul、4620/5=924copies/ul。
07
泊松分布
泊松分布是统计学上描述单位时间内某罕见事件发生次数的概率分布，它要求事件发生是相互独立且发生概率相等。数字PCR液滴发生尽量保证每个液滴最多只有一个目的分子，但不能排除有两个以上目的分子的罕见事件的发生，故用泊松分布进行校正。
Copies per droplet= - In (1-P)
其中P=Npos / Ntotal
copies/ul=- In (1-P)/droplet volum
根据检测的图形，即使阈值限的差异较大，但对浓度的绝对定量影响不大。
体会：液滴数字PCR无需依赖参考物或标准品，将荧光定量PCR的宏观扩增反应体系微观化，类似流式原理逐一检测微观化的扩增反应，从而得到样本的原始浓度和含量。但在实验室内需注意液滴生成体积是否足够等分析中质量控制和浓度换算等分析后质量控制。
参考资料：
1.吕建新, 王晓春. 临床分子生物学检验技术[M]. 人民卫生出版社, 2015.
2.伯乐XQ200ddPCR说明书
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