PCR技术自问世以来，在遗传病、病原体、癌基因等分子诊断领域和法医鉴定等方面发挥了巨大作用。按照PCR技术的演进，人们习惯性将PCR技术划分为三代：普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。以前也介绍了很多关于qPCR相关知识，这期给大家分享另外两种PCR技术——普通PCR技术和dPCR技术，以期让大家对这些技术有更进一步的认识。
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DN 片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。该技术是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经「高温变性—低温退火 — 引物延伸」三步反应的多次循环，使 DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。①DNA模版：可以是双链、单链、提取染色体的DNA、克隆的质粒DNA；②引物：一对寡聚DNA，分别与模板两侧的3’端序列互补，可使DNA序列得到扩增；③DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成；④缓冲液：提供DNA合成反应所需的PH,离子强度等环境；⑤4种单核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料。注：可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化；按照实验方案进行即可。优点：经典方法，国际和国内标准齐全；仪器试剂成本较低、PCR产物可以回收后做其他分子生物学实验。缺点：容易污染、操作繁琐、只能定性分析、敏感性中等、存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分。PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，只要能分离出一点 DNA，就能用 PCR 加以放大，进行比对。在普通 PCR 仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量 PCR 仪，其扩增原理和普通 PCR 仪扩增原理相同，只是 PCR 扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出，两者具体差异见下表：注：灵敏度指的是PCR扩增反应能够检测到目的基因最小值。特异性指的是在 PCR 扩增过程中，专一性扩增目的片段而非其他片段的性能。原因：①模板含有抑制物，含量低；②Buffer 对样品不合适；③引物设计不当或者发生降解；④反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。对策：①纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量；②更换 Buffer 或调整浓度；③重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者更换一管新引物；④降低退火温度、延长延伸时间。原因：①引物特异性差；②模板或引物浓度过高；③酶量过多；④Mg2+浓度偏高。对策：①重新设计引物或者使用巢式 PCR；②适当降低模板或引物浓度；③适当减少酶量；④降低 Mg2+浓度，或更换 mix。问题3：GC-rich（正常范围为40-60%，>60%为GC-rich）区域难以扩增原因：GC-rich 区域需要更高的温度才能打开双链，常规的变性温度下可能解链不完全; 同时由于单链的 G+C 丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹二级结构而使 PCR 引物难以结合到模板上，DNA 聚合酶也难以延伸或延伸停止，结果出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。对策：①提高预变性温度或变性时间，使双链完全打开；②TD-PCR（梯度 PCR ）；③换用热启动酶或 mix；④增加 DMSO 等共溶剂，协助 DNA 变性，降低引物 Tm 值，提高产物扩增特异性。原因：①模板不纯；②Buffer不合适；③退火温度偏低；④酶量过多；⑤dNTPs、Mg2+ 浓度偏高。对策：①纯化模板；②更换 Buffer 或 mix；③适当提高退火温度；④按浓度比例设置酶的添加量；⑤适当降低 dNTPs 和 Mg2+ 浓度；⑥减少反应循环次数。对策：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用；③各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了数字PCR的概念。dPCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，dPCR对结果的判定不依赖于扩增曲线循环Ct值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA的分子个数，能够对起始样本核酸分子绝对定量。分割单元数、荧光通道数、操作复杂性以及污染风险是评价数字PCR平台的重要指标。此外，使用多个数字PCR平台互相验证和使用定值准确的标准物质是评估数字PCR平台的主要方法。dPCR：digital PCR（数字PCR），是一种基于泊松分布原理建立的核酸分子绝对定量技术。通过将待测样本进行极限稀释，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行PCR扩增，可以检测到低至一个拷贝的突变。目前dPCR主要有两种形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。可以使用几种不同的方法来分配样品，包括微孔板、毛细管、油乳剂和带有核酸结合表面的小型化腔室阵列。样品的分配使人们可以通过假设分子种群遵循泊松分布来估计不同分子的数量，根据泊松分布的原理，反应体系中目标分子的拷贝数可以通过公式A=-ln[(N-X)/N]*N计算，从而解决了多个目标分子存在于单个液滴中的可能性。优点：实现绝对定量、更高的敏感性和特异性、可以检测低拷贝样品、操作过程和结果分析简单。缺点：仪器设备和试剂昂贵、操作复杂，检测时间长、成本较高、检测范围较窄，此方法适宜于对ctDNA或者其他低浓度样本的低频突变进行检测，特别适用于“液体活检”。基因表达：可对细微变化进行检测，准确性高，重复性佳。突变检测：可检测低含量的突变基因，突变序列检测灵敏度高。拷贝数变异CNV检测：可通过精确计量目的基因与参考基因，计算比值得到目的基因的拷贝数。二代测序数据验证：可直接对二代测序数据结果进行绝对定量分析。①可以实现绝对定量：常规PCR定量需要制定已知拷贝数的标准DNA曲线，但是由于待检样本与标准曲线不在统一体系，条件上会存在差异，另外加上PCR扩增效率的差异从而影响定量结果的准确性。而数字PCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可进行绝对定量。②样本需求量低：适用于珍贵样本或核酸降解严重的样本。③灵敏度高：数字PCR是将传统PCR反应体系分割成数万个独立PCR反应，这些反应可以精确地检测很小的目的片段差异、单拷贝甚至低浓度的混杂样本。且能避免非同源异质双链的形成。④高耐受性：由于目的序列被分配到多个独立反应体系中，显著降低了背景信号和抑制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。2013年dPCR被《麻省理工大学科技评论》评为十大突破技术之一，2017年入选《世界经济论坛》评出的全球十大新兴技术，经过几年的发展，目前在国内的临床分子检测已得以运用。目前市场上主流dPCR包括：①Life Technologies 3D数字PCR（芯片式数字PCR）：可认为是微孔数字PCR，主要是将20 ul反应体系分散到20000个微孔中进行反应，变成20000个反应体系，PCR反应结束后，采用CCD拍照，数阳性反应孔。②Bio-Rad 微滴数字PCR（油包水液滴式数字PCR）：将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系，PCR反应结束后，才有流式细胞术的原理，检测每一个液体，数阳性反应的液滴数量。③RainDance 的数字PCR（油包水液滴式数字PCR）：原理与伯乐微滴数字PCR相同，但是其液体形成能力比伯乐强很多，理论上可以产生1000万个小油滴。其中Raindance的价格最高、Bio-Rad其次、Life Technologies价格最低。技术的进步给PCR技术不断地注入新的活力，使核酸检测更方便、更准确。目前三代PCR技术各有其优缺点，也各有不同的应用领域，不具有一代取代另一代的关系，科研工作者可根据自己的实际情况选择适合的PCR技术！
